Misurazione diretta delle forze all'interno di fasci di microtubuli attivi ricostituiti

Summary

Qui, presentiamo un protocollo per ricostituire i fasci di microtubuli in vitro e quantificare direttamente le forze esercitate al loro interno utilizzando l’intrappolamento ottico simultaneo e la microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale. Questo test consente la misurazione su scala nanometrica delle forze e degli spostamenti generati dagli insiemi proteici all’interno delle reti di microtubuli attivi.

Abstract

Le reti di microtubuli sono impiegate nelle cellule per svolgere una vasta gamma di compiti, che vanno dall’agire come tracce per il trasporto delle vescicole al lavoro come array specializzati durante la mitosi per regolare la segregazione cromosomica. Le proteine che interagiscono con i microtubuli includono motori come chinesine e dineina, che possono generare forze attive e movimento direzionale, nonché proteine non motorie che reticolano i filamenti in reti di ordine superiore o regolano la dinamica dei filamenti. Ad oggi, gli studi biofisici sulle proteine associate ai microtubuli si sono concentrati in modo schiacciante sul ruolo delle singole proteine motorie necessarie per il trasporto delle vescicole e sono stati compiuti progressi significativi nel chiarire le proprietà generatrici di forza e la regolazione meccanochimica delle chinesine e delle dineine. Tuttavia, per i processi in cui i microtubuli agiscono sia come carico che come traccia, come durante lo scorrimento del filamento all’interno del fuso mitotico, si capisce molto meno sulla regolazione biofisica degli insiemi delle proteine reticolanti coinvolte. Qui, descriviamo in dettaglio la nostra metodologia per sondare direttamente la generazione e la risposta della forza all’interno di reti minime di microtubuli reticolati ricostituiti da microtubuli purificati e proteine mitotiche. Le coppie di microtubuli sono reticolate da proteine di interesse, un microtubulo è immobilizzato su un vetrino di copertura del microscopio e il secondo microtubulo è manipolato da una trappola ottica. La microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale simultanea consente la visualizzazione multicanale di tutti i componenti di questa rete di microtubuli mentre i filamenti si allontanano per generare forza. Dimostriamo anche come queste tecniche possono essere utilizzate per sondare le forze di spinta esercitate dagli insiemi di kinesina-5 e come le forze di frenata viscosa si verificano tra coppie di microtubuli scorrevoli reticolate dal mitotico MAP PRC1. Questi saggi forniscono approfondimenti sui meccanismi di assemblaggio e funzione del fuso e possono essere più ampiamente adattati per studiare la meccanica delle reti di microtubuli densi in diversi contesti, come l’assone e i dendriti dei neuroni e delle cellule epiteliali polari.

Introduction

Le cellule impiegano reti di microtubuli per eseguire un’ampia varietà di compiti meccanici, che vanno dal trasporto delle vescicole ^1,2,3 alla segregazione cromosomica durante la mitosi 4,5,6. Molte delle proteine che interagiscono con i microtubuli, come le proteine molecolari kinesina e dineina, generano forze e sono regolate da carichi meccanici. Per capire meglio come funzionano queste molecole critiche, i ricercatori hanno impiegato metodi biofisici a singola molecola, come l’intrappolamento ottico e la microscopia TIRF, per monitorare direttamente parametri critici come i tassi di passo scaricati, la processività e le relazioni forza-velocità per le singole proteine. La geometria sperimentale più comunemente usata è stata quella di attaccare le proteine motorie direttamente alle perle di intrappolamento la cui geometria sferica e le cui dimensioni imitano le vescicole sottoposte a trasporto motorizzato. Numerose chinesine, tra cui kinesin-1 7,8,9, kinesin-2 10,11,12, kinesin-3 ^13,14,15,16 kinesin-5^17,18, kinesin-8 ^19,20, nonché complessi dynein e dynein ^{21,22, 23,24,25}, sono stati studiati con questi metodi.

In molti processi cellulari, tuttavia, le proteine motorie e non motorie utilizzano microtubuli sia come traccia che come carico^26,27. Inoltre, in questi scenari in cui i filamenti di microtubuli sono reticolati in fasci di ordine superiore, queste proteine funzionano come insiemi piuttosto che singole unità. Ad esempio, all’interno delle cellule somatiche in divisione, dense reti di filamenti si auto-organizzano per costruire l’apparato del fuso mitotico^28,29,30. La rete di microtubuli del fuso interpolare è altamente dinamica ed è in gran parte organizzata con estremità inferiori che puntano verso i poli del fuso e estremità superiori che si sovrappongono vicino all’equatore del mandrino. I filamenti all’interno del fuso sono reticolati da proteine motorie come la chinesina-5 31,32,33, la chinesina-12 34,35,36 e la chinesina-14^37,38,39, o da proteine non motorie come PRC1 40,41,42,43 o NuMA ^{44,45, 46}. Spesso si muovono o subiscono stress meccanici durante processi come il flusso verso i poli o mentre coordinano la centratura cromosomica durante la metafase o la segregazione cromosomica durante l’anafase 47,48,49,50,51,52. L’integrità dell’apparato del fuso su scala micron attraverso la mitosi, quindi, si basa su un equilibrio attentamente regolato di forze di spinta e trazione generate e sostenute da questa rete di filamenti interagenti. Tuttavia, gli strumenti necessari per sondare questa regolazione meccanica e spiegare come gli insiemi proteici lavorano di concerto per coordinare i movimenti dei microtubuli e produrre le forze necessarie per assemblare correttamente il mandrino sono stati sviluppati solo di recente, e stiamo appena iniziando a capire le regole biofisiche che definiscono le reti dinamiche di microtubuli.

L’obiettivo di questo manoscritto è dimostrare i passaggi necessari per ricostituire coppie di microtubuli reticolati in vitro, immobilizzare questi fasci in una camera di microscopia che consenta la visualizzazione simultanea della fluorescenza sia dei microtubuli che delle proteine reticolanti e la misurazione della forza su scala nanometrica ed elaborare questi dati in modo robusto. Descriviamo in dettaglio i passaggi necessari per polimerizzare stabilmente microtubuli marcati con fluorescenza, preparare i vetrini di copertura del microscopio per il fissaggio, preparare perle di polistirolo per esperimenti di intrappolamento ottico e assemblare reti di filamenti reticolati che preservano la loro funzionalità in vivo consentendo al contempo la manipolazione biofisica diretta.

Protocol

1. Preparazione di microtubuli NOTA: Quando si utilizzano proteine reticolanti marcate con GFP, l’etichettatura dei fluorofori organici rossi (ad esempio, rodamina) e rosso lontano (ad esempio, HiLyte647 biotinilato, indicato come rosso lontano biotinilato nel resto del testo) l’etichettatura dei fluorofori organici dei microtubuli funziona bene. La diafonia minima tra tutti e tre i canali può essere ottenuta durante l’imaging utilizzando un filtro a fluorescenza a riflessione …

Representative Results

La preparazione di fasci di microtubuli adatti all’analisi biofisica è considerata di successo se sono soddisfatti molti dei criteri chiave. In primo luogo, l’imaging in tre colori dovrebbe rivelare due microtubuli allineati con una concentrazione di proteina reticolante che decora preferenzialmente la regione di sovrapposizione (Figura 5B, C e Figura 6B). Idealmente, la distanza tra il bordo di sovrapposizione e l’estremità l…

Discussion

Le reti di microtubuli sono impiegate da una miriade di tipi di cellule per svolgere una vasta gamma di compiti che sono fondamentalmente di natura meccanica. Per descrivere come funzionano le cellule sia in stato sano che in stato di malattia, è fondamentale capire come queste reti su scala micron sono organizzate e regolate dalle proteine di dimensioni nanometriche che collettivamente le costruiscono. Strumenti biofisici come le pinzette ottiche sono adatti per sondare la meccanochimica di proteine chiave su questa sc…

Materials

10W Ytterbium Fiber Laser, 1064nm	IPG Photonics	YLR-10-1064-LP
405/488/561/640nm Laser Quad Band Set for TIRF applications	Chroma	TRF89901v2
6x His Tag Antibody, Biotin Conjugate	Invitrogen	#MA1-21315-BTIN
Acetone, HPLC grade	Fisher Scientific	18-608-395
Alpha casein from bovine milk	Sigma	1002484390
ATP	Fisher Scientific	BP413-25
Benzonase	Novagen	70746-3
Biotin-PEG-SVA-5000	Laysan Bio, Inc.	NC0479433
BL21 (DE3) Rosetta Cells	Millipore Sigma	71-400-3
Catalase	MP Biomedicals LLC	190311
CFI Apo 100X/1.49NA oil immersion TIRF objective	Nikon	N/A
Chloramphenicol	ACROS Organics	227920250
Coverslip Mini-Rack, for 8 coverslips	Fisher Scientific	C14784
Delicate Task Wipers	Kimberly-Clark	34120
Dextrose Anhydrous	Fisher Scientific	BP3501
D-Sucrose	Fisher Scientific	BP220-1
DTT	Fisher Scientific	BP172-25
Ecoline Immersion Thermostat E100 with 003 Bath	LAUDA-Brinkmann	27709
EDTA	Fisher Scientific	BP118-500
EGTA	Millipore Corporation	32462-25GM
FIJI / Image J	https://fiji.sc/	N/A
Frosted Microscope Slides	Corning	12-553-10	75mmx25mm, with thickness of 0.9-1.1mm
Glucose Oxidase	MP Biomedicals LLC	195196	Type VII, without added oxygen
GMPCPP	Jena Biosciences	JBS-NU-405S	Can be stored for several months at -20 °C and up to a year at -80 °C
Gold Seal-Cover Glass	Thermo Scientific	3405
HEPES	Fisher Scientific	BP310-500
Imidazole	Fisher Scientific	03196-500
IPTG	Fisher Scientific	BP1755-10
Laboratory dessicator	Bel-Art	999320237	190mm plate size
Kanamycin Sulfate	Fischer Scientific	BP906-5
KIF5A K439 (aa:1-439)-6His	Gilbert Lab, RPI	N/A	doi.org/10.1074/jbc.RA118.002182
Kimwipe	Kimberley Clark	Z188956	lint-free tissue
Immersion Oil, Type B	Cargille	16484
Lens Tissue	ThorLabs	MC-5
LuNA Laser launch (4 channel: 405, 488, 561, 640nm)	Nikon	N/A
Lysozyme	MP Biomedicals LLC	100834
Magnesium Acetate Tetrahydrate	Fisher Scientific	BP215-500
Microfuge 18	Beckman Coulter	367160
MPEG-SVA MW-5000	Laysan Bio, Inc.	NC0107576
Neutravadin	Invitrogen	PI31000
Nikon Ti-E inverted microscope	Nikon	N/A	Nikon LuN4 Laser
Ni-NTA Resin	Thermo Scientific	88221
Oligonucleotide – CACCTATTCTGAGTTTGCGCGA GAACTTTCAAAGGC	IDT	N/A
Oligonucleotide – GCCTTTGAAAGTTCTCGCGCAA ACTCAGAATAGGTG	IDT	N/A
Open-top thickwall polycarbonate tube, 0.2 mL, 7 mm x 22 mm	Beckman Coulter	343755
Optima-TLX Ultracentrifuge	Beckman Coulter	361544
Paclitaxel (Taxol equivalent)	Thermo Fisher Scientific	P3456
PIPES	ACROS Organics	172615000
PMSF	Millipore	7110-5GM
Porcine Tubulin, biotin label	Cytoskeleton, Inc.	T333P
Porcine Tubulin, HiLyte 647 Fluor	Cytoskeleton, Inc.	TL670M	far red labelled
Porcine Tubulin, Rhodamine	Cytoskeleton, Inc.	TL590M
Porcine Tubulin, Tubulin Protein	Cytoskeleton, Inc.	T240
Potassium Acetate	Fisher Scientific	BP364-500
Prime 95B sCMOS camera	Photometric	N/A
Quadrant Detector Sensor Head	ThorLabs	PDQ80A
Quikchange Lightning Kit	Agilent Technologies	210518
Sodium Bicarbonate	Fisher Scientific	S233-500
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous	Fisher Scientific	BP332-500
Square Cover Glasses	Corning	12-553-450	18 mm x 18 mm, with thickness of 0.13-0.17 mm
Streptavidin Microspheres	Polysciences Inc.	24162-1
Superose-6 Column	GE Healthcare	29-0915–96
TCEP	Thermo Scientific	77720
TLA-100 Fixed-Angle Rotor	Beckman Coulter	343840
Ultrasonic Cleaner (Sonicator)	Vevor	JPS-08A(DD)	304 stainless steel, 40 kHz frequency, 60 W power
Vectabond APTES solution	Vector Laboratories	SP-1800-7
Windex Powerized Glass Cleaner with Ammonia-D	S.C. Johnson	SJN695237