Chip de glomérulo renal isogénico diseñado a partir de células madre pluripotentes inducidas por humanos
Summary
Aquí se presenta un protocolo para diseñar un sistema personalizado de órgano en un chip que recapitula la estructura y función de la barrera de filtración glomerular renal mediante la integración de células endoteliales epiteliales y vasculares genéticamente emparejadas diferenciadas de las células madre pluripotentes inducidas por humanos. Este sistema de bioingeniería puede avanzar en la medicina de precisión renal y aplicaciones relacionadas.
Abstract
La enfermedad renal crónica (ERC) afecta al 15% de la población adulta de los Estados Unidos, pero el establecimiento de terapias dirigidas se ha visto limitado por la falta de modelos funcionales que puedan predecir con precisión las respuestas biológicas humanas y la nefrotoxicidad. Los avances en la medicina de precisión renal podrían ayudar a superar estas limitaciones. Sin embargo, los modelos in vitro previamente establecidos del glomérulo renal humano, el sitio primario para la filtración de sangre y un objetivo clave de muchas enfermedades y toxicidades farmacológicas, generalmente emplean poblaciones celulares heterogéneas con características funcionales limitadas y antecedentes genéticos inigualables. Estas características limitan significativamente su aplicación para el modelado de enfermedades específicas del paciente y el descubrimiento terapéutico.
Este artículo presenta un protocolo que integra epitelio glomerular derivado de células madre pluripotentes inducidas humanas (iPS) y endotelio vascular de un solo paciente para diseñar un chip de glomérulo renal microfluídico isogénico y vascularizado. El chip de glomérulo resultante está compuesto por capas de células endoteliales y epiteliales derivadas de células madre que expresan marcadores específicos del linaje, producen proteínas de la membrana basal y forman una interfaz tejido-tejido que se asemeja a la barrera de filtración glomerular del riñón. El chip de glomérulo diseñado filtra selectivamente las moléculas y recapitula la lesión renal inducida por fármacos. La capacidad de reconstituir la estructura y función del glomérulo renal utilizando tipos de células isogénicas crea la oportunidad de modelar la enfermedad renal con la especificidad del paciente y avanzar en la utilidad de los órganos en chips para la medicina de precisión renal y aplicaciones relacionadas.
Introduction
Los dispositivos de órgano en un chip son modelos 3D dinámicos in vitro que emplean estimulación molecular y mecánica, así como vascularización, para formar interfaces tejido-tejido que modelan la estructura y función de órganos específicos. Los dispositivos de órgano en un chip previamente establecidos que tenían como objetivo recapitular el glomérulo del riñón (chips de glomérulo) consistían en líneas celulares animales1 o líneas celulares primarias e inmortalizadas humanas de fuentes heterogéneas 2,3. El uso de fuentes celulares genéticamente heterogéneas presenta variaciones que limitan significativamente los estudios de respuestas específicas del paciente y genética o mecanismos de enfermedad 4,5. Abordar este desafío depende de la disponibilidad de líneas celulares isogénicas originadas en individuos específicos con perfiles moleculares y genéticos preservados para proporcionar un microambiente más preciso para la ingeniería de modelos in vitro 2,3,6. Las líneas celulares isogénicas de origen humano ahora se pueden generar fácilmente debido a los avances en el cultivo celular iPS humano. Debido a que las células iPS humanas son típicamente de origen no invasivo, pueden autorrenovarse indefinidamente y diferenciarse en casi cualquier tipo de célula, sirven como una fuente atractiva de células para el establecimiento de modelos in vitro, como el chip glomérulo 7,8. La barrera de filtración glomerular es el sitio principal para la filtración de sangre. La sangre se filtra primero a través del endotelio vascular, la membrana basal glomerular, y finalmente a través de epitelio especializado llamado podocitos. Los tres componentes de la barrera de filtración contribuyen a la filtración selectiva de moléculas. Aquí se presenta un protocolo para establecer un dispositivo de órgano en un chip interconectado con endotelio vascular y epitelio glomerular de una sola fuente de células iPS humanas. Si bien este protocolo es especialmente útil para diseñar un chip isogénico y vascularizado para recapitular la barrera de filtración glomerular, también proporciona un plan para desarrollar otros tipos de órganos personalizados en chips y plataformas multiorgánicas, como un sistema isogénico de “cuerpo en un chip”.
El protocolo descrito en este documento comienza con la diferenciación divergente de las células iPS humanas en dos linajes separados: mesodermo lateral y células de mesodermo, que posteriormente se diferencian en endotelio vascular y epitelio glomerular, respectivamente. Para generar células de mesodermo lateral, las células iPS humanas se sembraron en placas recubiertas con matriz de membrana basal 1 y se cultivaron durante 3 días (sin intercambio de medios) en medio N2B27 suplementado con el activador Wnt, CHIR 99021, y el potente inductor del mesodermo, morfogenético óseo 4 (BMP4). Las células del mesodermo lateral resultantes se caracterizaron previamente por la expresión de braquiuria (T), homeobox mixto pareado (MIXL) y eomesodermina (EOMAS)9. Posteriormente, las células del mesodermo lateral se cultivaron durante 4 días en un medio suplementado con VEGF165 y Forskoline para inducir células endoteliales vasculares que se clasificaron en función de la expresión de VE-Cadherina y / o PECAM-1 utilizando clasificación celular activada magnéticamente (MACS). Las células endoteliales vasculares resultantes (viEC) se expandieron cultivándolas en matraces recubiertos de 3 de la matriz de la membrana basal hasta que estuvieran listas para sembrar en el dispositivo microfluídico.
Para generar células de mesodermo, las células iPS humanas se sembraron en placas recubiertas de matriz de membrana basal 2 y se cultivaron durante 2 días en un medio que contenía activina A y CHIR99021. Las células del mesodermo resultantes se caracterizaron por la expresión de HAND1, grosecoide y brachury (T) como se describió anteriormente 2,10,11. Para inducir la diferenciación celular intermedia del mesodermo (IM), las células del mesodermo se cultivaron durante 14 días en un medio suplementado con BMP-7 y CHIR99021. Las células IM resultantes expresan el tumor de Wilm 1 (WT1), el gen de caja pareada 2 (PAX2) y la proteína relacionada 1 omitida impares (OSR-1)2,10,11.
Se diseñó un chip microfluídico basado en polidimetilsiloxano (PDMS) de dos canales para recapitular la estructura de la barrera de filtración glomerular in vitro. El canal urinario es de 1.000 μm x 1.000 μm (ancho x alto) y la dimensión del canal capilar es de 1.000 μm x 200 μm (ancho x alto). Los ciclos cíclicos de estiramiento y relajación fueron facilitados por las cámaras huecas presentes a cada lado de los canales fluídicos. Las células se sembraron en una membrana flexible de PDMS (50 μm de espesor) que separa los canales urinario y capilar. La membrana está equipada con poros hexagonales (7 μm de diámetro, 40 μm de separación) para ayudar a promover la señalización intercelular (Figura 1A)2,12. Dos días antes de que se completara la inducción IM, los chips microfluídicos se recubrieron con la matriz de membrana basal 2. Los viECs se sembraron en el canal capilar del chip microfluídico utilizando medio de mantenimiento endotelial 1 día antes de que se completara la inducción IM, y el chip se volteó boca abajo para permitir la adhesión celular en el lado basal de la membrana PDMS recubierta de ECM. El día en que se completó la inducción IM, las células se sembraron en el canal urinario del chip microfluídico utilizando un medio suplementado con BMP7, Activin A, CHIR99021, VEGF165 y todo el ácido transretinoico para inducir la diferenciación de podocitos dentro del chip. Al día siguiente, los depósitos de medios se llenaron con medio de inducción de podocitos y medio de mantenimiento endotelial, y se aplicó una tensión mecánica del 10% a 0,4 Hz y flujo de fluido (60 μL / h) a los chips.
Los chips microfluídicos celularizados se cultivaron durante 5 días adicionales utilizando medio de inducción de podocitos (en el canal urinario) y medio de mantenimiento endotelial (en el canal vascular). Los chips de glomérulo renal resultantes se cultivaron durante hasta 7 días adicionales en medios de mantenimiento tanto para el podocitos como para las células endoteliales. Los podocitos diferenciados expresaron positivamente proteínas específicas del linaje, incluyendo podocina y nefrina 13,14, mientras que los viECs expresaron positivamente las proteínas de identificación de linaje PECAM-1 y VE-Cadherina, todas moléculas esenciales para mantener la integridad de la barrera de filtración glomerular 15,16 . Se encontró que los podocitos y los viEC secretan la proteína de la membrana basal glomerular más abundante, el colágeno IV, que también es importante para la maduración y función del tejido.
Se encontró que el sistema de tres componentes de la barrera de filtración (endotelio, membrana basal y epitelio) en los chips de glomérulo filtra selectivamente las moléculas y responde a un tratamiento farmacológico nefrotóxico quimioterápico. Los resultados del tratamiento farmacológico indicaron que el chip de glomérulo se puede utilizar para estudios de nefrotoxicidad y para el modelado de enfermedades. Este protocolo proporciona la guía general para diseñar un chip de glomérulo renal microfluídico funcional a partir de derivados isogénicos de células iPS. Los análisis posteriores del chip de ingeniería se pueden llevar a cabo según lo desee el investigador. Para obtener más información sobre el uso del chip glomérulo para modelar la lesión glomerular inducida por fármacos, consulte publicaciones anteriores 2,12.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este informe, describimos un protocolo para derivar endotelio vascular y epitelio glomerular (podocitos) de una línea celular iPS humana isogénica y el uso de estas células para diseñar un sistema 3D de órgano en un chip que imita la estructura, la interfaz tejido-tejido y la función de filtración molecular del glomérulo renal. Este chip de glomérulo está equipado con endotelio y epitelio glomerular que, juntos, proporcionan una barrera para filtrar selectivamente las moléculas.
<p class="jove_content"…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por la Escuela Pratt de Ingeniería de la Universidad de Duke, la División de Nefrología del Departamento de Medicina de Duke, una Beca Whitehead en Investigación Biomédica y un Premio de Investigación Genentech para S. Musah. Y. Roye recibió la beca de la Fundación Alfred P. Sloan de la Universidad de Duke y la beca de posgrado William M. “Monty” Reichert del Departamento de Ingeniería Biomédica de la Universidad de Duke. La línea celular iPS DU11 (clon #11 de la Universidad de Duke) se generó en la instalación central de Duke iPSC y nos la proporcionó el Laboratorio Bursac de la Universidad de Duke. Los autores agradecen a N. Abutaleb, J. Holmes, R. Bhattacharya e Y. Zhou por su asistencia técnica y útiles discusiones. Los autores también desean agradecer a los miembros del Musah Lab por sus útiles comentarios sobre el manuscrito. Los autores agradecen al Laboratorio Segura el regalo de un citómetro de flujo Acuri C6.
Materials
| Antibodies | |||
| Alexa Fluor 488- and Alexa Fluor 594-conjugated secondary antibodies | Thermo/Life Technologies | A32744; A32754; A-11076; A32790; A21203; A11015 | |
| Collagen IV | Thermo/Life Technologies | 14-9871-82 | |
| Nephrin | Progen | GP-N2 | |
| PECAM-1 | R&D Systems | AF806 | |
| Podocin | Abcam | ab50339 | |
| VE-Cadherin | Santa Cruz | sc-9989 | |
| Basement membrane matrices | |||
| Corning Fibronectin, Human | Corning | 356008 | Basement membrane (3) |
| iMatrix-511 Laminin-E8 (LM-E8) fragment | Iwai North America | N8922012 | Basement membrane matrix (2) |
| Matrigel hESC-qualified matrix, 5-mL vial | BD Biosciences | 354277 | Basement membrane matrix (1); may show lot-to-lot variation |
| Cells | |||
| DU11 human iPS cells | The DU11 (Duke University clone #11) iPS cell line was generated at the Duke iPSC Core Facility and provided to us by the Bursac Lab at Duke University. The line has been tested and found to be free of mycoplasma (last test in November 2021) and karyotype abnormalities (July 2019) | ||
| Culture medium growth factors and media supplements | |||
| 0.5M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575020 | |
| 2-Mercaptoethanol | Thermo/Life Technologies | 21985023 | |
| Albumin from Bovine serum, Texas Red conjugate | Thermo/Life Technologies | A23017 | |
| All-trans retinoic acid (500 mg) | Stem Cell Technologies | 72262 | |
| B27 serum-free supplement | Thermo/Life Technologies | 17504044 | |
| B-27 supplement (50x) without Vitamin A | Thermo/Life Technologies | 12587010 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| CHIR99021 | Stemgent | 04-0004 | May show lot-to-lot variation |
| Complete medium kit with CultureBoost-R | Cell Systems | 4Z0-500-R | Podocyte maintenance media |
| DMEM/F12 | Thermo/Life Technologies | 12634028 | |
| DMEM/F12 with GlutaMAX supplement | Thermo/Life Technologies | 10565042 | DMEM/F12 with glutamine |
| Forskolin (Adenylyl cyclase activator) | Abcam | ab120058 | |
| GlutaMAX supplement | Thermo/Life Technologies | 35050061 | glutamine supplement |
| Heat-inactivated FBS | Thermo/Life Technologies | 10082147 | |
| Heparin solution | Stem Cell Technologies | 7980 | |
| Human Activin A | Thermo/Life Technologies | PHC9544 | |
| Human BMP4 | Preprotech | 120-05ET | |
| Human BMP7 | Thermo/Life Technologies | PHC9544 | |
| Human VEGF | Thermo/Life Technologies | PHC9394 | |
| Inulin-FITC | Sigma-Aldrich | F3272 | |
| mTeSR1 medium | Stem Cell Technologies | 05850 | Human iPS cell culture media (CCM). Add 5x supplement according to the manufacturer. Human iPS CCM can be stored for up to 6 months at -20 °C. |
| N-2 Supplement (100x) | Thermo/Life Technologies | 17502048 | |
| Neurobasal media | Thermo/Life Technologies | 21103049 | Lateral mesoderm basal media |
| PBS (Phosphate-buffered saline) | Thermo/Life Technologies | 14190-250 | |
| Penicillin-streptomycin, liquid (100x) | Thermo/Life Technologies | 15140-163 | |
| ROCK inhibitor (Y27632) | Tocris | 1254 | |
| StemPro-34 SFM | Thermo/Life Technologies | 10639011 | Endothelial cell culture medium (CCM). Add supplement according to manufacturer. Endothelial CCM can be stored for up to two weeks at 4 °C or -20 °C for up to 6 months. |
| TGF-Beta inhibitor (SB431542) | Stem Cell Technologies | 72234 | |
| Enzymes and other reagents | |||
| Accutase | Thermo/Life Technologies | A1110501 | Cell detachment buffer |
| Dimethyl Suloxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2438 | |
| Ethanol solution, 70% (vol/vol), biotechnology grade | VWR | 97065-058 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Thermo/Life Technologies | 28906 | |
| Sterile distilled water | Thermo/Life Technologies | 15230162 | |
| Triton X-100 | VWR | 97062-208 | |
| Equipment | |||
| Trypsin EDTA, 0.05% | Thermo/Life Technologies | 25300-120 | |
| (Orb) Hub module | Emulate | ORB-HM1 | |
| 100mm x 15 mm round petri dish | Fisherbrand | FB087579B | |
| 120 x 120 mm square cell culture dish | VWR | 688161 | |
| Accuri C6 | BD Biosciences | ||
| Aspirating pipettes, individually wrapped | Corning | 29442-462 | |
| Aspirating Unit | SP Bel-Art | F19917-0150 | |
| Avanti J-15R Centrifuge | Beckman Coulter | B99516 | |
| Conical centrifuge tube, 15 mL | Corning | 352097 | |
| Conical centrifuge tube, 50 mL | Corning | 352098 | |
| EVOS M7000 | Thermo/Life Technologies | AMF7000 | Fluorescent microscope to take images of fixed and stained cells. |
| Hemocytometer | VWR | 100503-092 | |
| Heracell VIOS 160i CO2 incubator | Thermo/Life Technologies | 51030403 | |
| Inverted Zeiss Axio Observer equipeed with AxioCam 503 camera | Carl Zeiss Micrscopy | 491916-0001-000(microscope) ; 426558-0000-000(camera) | |
| Kimberly-Clark nitrile gloves | VWR | 40101-346 | |
| Kimwipes, large | VWR | 21905-049 | |
| Leoca SP8 Upright Confocal Microscope | |||
| Media reservoir (POD Portable Module) | Emulate | POD-1 | |
| Microplate shaker | VWR | 12620-926 | |
| Organ-chip | Emulate | S-1 Chip | |
| Organ-chip holder | Emulate | AK-CCR | |
| P10 precision barrier pipette tips | Denville Scientific | P1096-FR | |
| P100 barrier pipette tips | Denville Scientific | P1125 | |
| P1000 barrier pipette tips | Denville Scientific | P1121 | |
| P20 barrier pipette tips | Denville Scientific | P1122 | |
| P200 barrier pipette tips | Denville Scientific | P1122 | |
| Plasma Asher | Quorum tech | K1050X RF | This Plasma Etcher/Asher/Cleaner was used as a part of Duke University's Shared Materials Instrumentation Facility (SMiF). |
| Round bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap | Corning | 352235 | |
| Serological pipette, 10 mL, indivdually wrapped | Corning | 356551 | |
| Serological pipette, 25 mL, indivdually wrapped | Corning | 356525 | |
| Serological pipette, 5 mL, indivdually wrapped | Corning | 356543 | |
| Steriflip, 0.22 µm, PES | EMD Millipore | SCGP00525 | |
| Sterile Microcentrifuge tubes | Thomas Scientific | 1138W14 | |
| T75cm2 cell culture flask with vent cap | Corning | 430641U | |
| Tissue culture-treated 12 well plates | Corning | 353043 | |
| Tissue culture-treated 6 well plates | Corning | 353046 | |
| Vacuum modulator and perstaltic pump (Zoe Culture Module) | Emulate | ZOE-CM1 | Organ Chip Bioreactor |
| VE-Cadherin CD144 anti-human antibody – APC conjugated | Miltenyi Biotec | 130-126-010 | |
| Wide-beveled cell lifter | Corning | 3008 | |
| MACS | |||
| CD144 MicroBeads, human | Miltenyi Biotec | 130-097-857 | |
| CD31 MicroBead Kit, human | Miltenyi Biotec | 130-091-935 | |
| LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 |
References
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