Intravitreala injektioner utfördes i fårögat i syfte att leverera virusmedierad genterapi till näthinnan.
Det finns flera metoder för leverans av terapeutiska medel till näthinnan, inklusive intravitreal (IVT), subretinal, suprachoroidal, periokulär eller topisk administrering. IVT-läkemedelsleverans innebär en injektion i ögats glasögonhumor, en gelatinös substans som fyller ögats bakre kammare och bibehåller ögonglobens form. Även om IVT-vägen är mindre specifikt riktad än subretinal leverans, är den mycket mindre invasiv och används ofta i kliniska miljöer för en rad okulära sjukdomar.
Vi har tidigare visat effekten av intravitreal leverans av en adenoassocierad virusprodukt (AAV)-medierad genterapiprodukt (AAV9. CLN5) hos får med en naturligt förekommande CLN5-form av neuronal ceroid lipofuscinos (NCL). Drabbade får fick IVT-genterapi på ena ögat, medan det andra obehandlade ögat fungerade som en intern kontroll. Retinal struktur och funktion bibehölls i det behandlade ögat upp till 15 månader efter behandlingen, medan det obehandlade ögat uppvisade gradvis minskande funktion och svår atrofi under postmortemundersökning. Baserat på fårstudierna godkändes CLN5-genterapiprodukten som en kandidat för prövningsläkemedel (IND) av United States Food and Drug Administration i september 2021. Detta dokument beskriver det kirurgiska protokollet för IVT-leverans av en terapeutisk viral vektor till fårögat.
Flera metoder kan användas för att leverera terapeutiska medel till näthinnan, inklusive intravitreal (IVT), subretinal, suprachoroidal, periokulär eller topisk administrering. Varje administreringsväg innebär att man övervinner barriärer som blod-näthinnebarriären eller de inre och yttre begränsande membranen och har varierande effekthastigheter beroende på läkemedlet som levereras och det specifika näthinnemålet 1,2.
IVT drug delivery innebär en injektion i ögats glasögonhumor, en gelatinös substans som upptar ögats bakre kammare. Den primära funktionen hos glaskroppen är att bibehålla formen på ögongloben och hålla okulära vävnader, såsom linsen och näthinnan, på plats. Glaskroppen består till stor del av vatten, med små mängder kollagen, hyaluronsyra och andra icke-kollagena proteiner3. IVT-injektion är ett enkelt och vanligt förfarande som används rutinmässigt för att behandla ett brett spektrum av okulära tillstånd, inklusive åldersrelaterad makuladegeneration, diabetiskt makulaödem, diabetisk retinopati, retinal venocklusion och flera ärftliga retinala dystrofier 4,5.
Neuronala ceroid lipofuscinoser (NCL; Batten sjukdom) är en grupp dödliga lysosomala lagringssjukdomar som orsakar allvarlig degenerering av hjärnan och näthinnan. Det finns för närvarande 13 kända varianter av NCL som härrör från mutationer i olika gener (CLN1-8, CLN10-14) som främst drabbar barn men har varierande debutålder och sjukdomens svårighetsgrad6. NCL delar gemensamma progressiva symtom, inklusive kognitiv och motorisk nedgång, anfall och synförlust. Det finns inget botemedel mot NCL; hjärnriktad enzymersättningsterapi är dock för närvarande i kliniska prövningar för CLN2-sjukdom7,8, och AAV-medierad genterapi har visat stort löfte i prekliniska studier, med en klinisk prövning för CLN5-genterapi som förväntas börja 2022 9,10.
Många andra arter utvecklar naturligt förekommande former av NCL, inklusive katter, hundar, får och kor. Två fårmodeller av NCL är för närvarande under aktiv studie i Nya Zeeland: en CLN5-sjukdomsmodell i Borderdale-får och en CLN6-sjukdomsmodell i South Hampshire-får. Drabbade får uppvisar många av de kliniska och patologiska egenskaperna hos den mänskliga sjukdomen, inklusive retinalatrofi och synförlust10,11. Även om hjärnriktad CLN5-genterapi hos får med CLN5-sjukdom kan förhindra eller stoppa hjärnatrofi och klinisk nedgång, förlorar de behandlade fåren fortfarande sin syn9. Detta belyste behovet av att behandla näthinnan för att bevara synen och upprätthålla en bättre livskvalitet, vilket ledde till upprättandet av ett protokoll för okulär genterapi hos får.
Fårögat representerar en bra modell av det mänskliga ögat på grund av dess likhet i ögonglobdimensioner, glaskroppsvolym och retinal struktur10,12,13. Detta dokument beskriver det kirurgiska protokollet för IVT-leverans av en liten volym (≤100 μL) terapeutisk virusvektor till fårögat.
Intravitreala injektioner är ett av de vanligaste kirurgiska ingreppen inom human oftalmologi och har visat sig vara effektiva för att leverera AAV-medierade genterapier till fårens näthinna. Vi hade tidigare visat effekten av AAV9. CLN5-genterapi som levereras intravitret för att dämpa retinal dysfunktion och degeneration hos får med CLN5 NCL15. Förhoppningen är att översättningen av denna administreringsväg till humana NCL-patienter också kommer att visa sig vara till nytta.
<p …The authors have nothing to disclose.
Författarna vill erkänna Dr. Steve Heap (BVSc, CertVOphthal) för hans hjälp med att upprätta detta protokoll och utföra de injektioner som beskrivs av Murray et al.15. Författarna erkänner också finansiering från CureKids Nya Zeeland, Canterbury Medical Research Foundation, Neurogene Inc och Batten Disease Support and Research Association.
1 mL low dead-space safety syringe with permanently attached 0.5 inch needle | Fisher Scientific, Auckland, New Zealand | 05-561-28 | Covidien Monoject Tuberculin Safety syringe or similar |
1.5 mL microcentrifuge tube | Sigma Aldrich | HS4323 | Autoclave tubes to sterilise prior to use |
Anesthesia machine with gas bench and monitor | Hyvet Anesthesia, Christchurch, New Zealand | ||
Antibiotic eye drops | Teva Pharma Ltd, Auckland, New Zealand | Commercial name: Chlorafast (0.5% chloramphenicol) | |
BrightMount plus anti-fade mounting medium | Abcam, Cambridge, United Kingdom | ab103748 | |
DAPI (4′ ,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) | Sigma Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | 10236276001 | |
Diazepam sedative | Ilium, Troy Laboratories Pty Ltd, Tauranga, New Zealand | 5 mg/mL | |
Endotracheal tubes | Flexicare Medical Ltd, Mountain Ash, United Kingdom | Standard, cuffed. Sizes 7, 7.5, or 8 depending on sheep size | |
Eye speculum | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | KP151/14 | Nopa Barraquer-Colibri (10 mm) |
Fenestrated surgical drape | Amtech Medical Ltd, Whanganui, New Zealand | DI583 | Or similar |
Filter Tips | Interlab, Auckland, New Zealand | 10, 200, and 1,000 µL | |
Formaldehyde solution (37%) | Fisher Scientific, Auckland, New Zealand | AJA809-2.5PL | Make up to 10% in distilled water with 0.9% NaCl |
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 594 | Invitrogen Carlsbad, CA, USA | A-11012 | Use at a dilution of 1:500 |
Isoflurane anesthetic | Attane, Bayer Animal Health, Auckland, New Zealand | ||
Ketamine HCl anesthetic/analgesic | PhoenixPharm Distributors Ltd, Auckland, New Zealand | 100 mg/mL | |
Laryngoscope (veterinary) | KaWe Medical, Denmark | Miller C blade, size 2 | |
Needles | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | 302025 | BD Hypodermic Needles, or similar |
Non-steroidal anti-inflammatory | Boehringer Ingelheim (NZ) Ltd, Auckland, New Zealand | 49402/008 | Commercial name: Metacam 20 (20 mg/mL meloxicam) |
Non-toothed forceps | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | AB864/16 | Or similar |
Non-toothed hemostat | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | AA150/12 | Or similar |
Normal goat serum | Thermo Fisher Scientific, Christchurch, New Zealand | 16210072 | |
Oxygen (medical) | BOC Gas, Christchurch, New Zealand | D2 cylinder, gas code 180 | |
Phosphate buffered saline | Thermo Fisher Scientific, Christchurch, New Zealand | 10010023 | Sterile, filtered |
Povidone-Iodine solution | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | 005835 | Commercial name: Betadine (10% povidone-iodine) |
Rabbit anti-cow glial fibrillary acidic protein (GFAP) | Dako, Glostrup, Denmark | Z0334 | Use at a dilution of 1:2,500 |
Self-complementary adeno-associated virus serotype 9, containing the chicken beta action (CBh) promoter and codon-optimized ovine CLN5 | University of North Carolina Vector Core, NC, USA. | scAAV9/CBh-oCLN5opt | |
Sodium Chloride 0.9% IV Solution | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | AHB1322 | Commercial name: Saline solution |
Subcutaneous antibiotics | Intervet Schering Plough Animal Health Ltd, Wellington, New Zealand | Commercial name: Duplocillin LA (150,000 IU/mL procaine penicillin and 115,000 IU/mL benzathine penicillin) | |
Surgical sharp blunt curved scissors | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | SSSHBLC130 | |
Terumo Syringe Luer Lock | Amtech Medical Ltd, Whanganui, New Zealand | SH159/SH160 | Sterile syringes; 10 mL for drawing up induction drugs, 20 mL for drawing up saline |
Virkon Disinfectant Powder | EBOS Group Ltd, Christchurch, NZ | 28461115 |