Intravitreale injecties werden uitgevoerd in het schapenoog met als doel virale gemedieerde gentherapie op het netvlies af te leveren.
Er zijn verschillende methoden voor de afgifte van therapeutische middelen aan het netvlies, waaronder intravitreale (IVT), subretinale, suprachoroïdale, perioculaire of topische toediening. Ivt-medicijnafgifte omvat een injectie in de glasvochthumor van het oog, een gelatineuze substantie die de achterste kamer van het oog vult en de vorm van de oogbol behoudt. Hoewel de IVT-route minder specifiek gericht is dan subretinale toediening, is het veel minder invasief en wordt het veel gebruikt in klinische omgevingen voor een reeks oogziekten.
We hebben eerder de werkzaamheid aangetoond van intravitreale toediening van een adeno-geassocieerd virus (AAV) -gemedieerd gentherapieproduct (AAV9). CLN5) bij schapen met een natuurlijk voorkomende CLN5-vorm van neuronale ceroïde lipofuscinose (NCL). Getroffen schapen kregen IVT-gentherapie in één oog, waarbij het andere onbehandelde oog diende als een interne controle. De retinale structuur en functie werden tot 15 maanden na de behandeling in het behandelde oog gehandhaafd, terwijl het onbehandelde oog tijdens postmortaal onderzoek een progressief afnemende functie en ernstige atrofie vertoonde. Op basis van de schapenstudies werd het CLN5-gentherapieproduct in september 2021 door de Amerikaanse Food and Drug Administration goedgekeurd als kandidaat-experimenteel nieuw medicijn (IND). Dit artikel beschrijft het chirurgische protocol voor IVT-toediening van een therapeutische virale vector aan het schapenoog.
Verschillende methoden kunnen worden gebruikt om therapeutische middelen aan het netvlies toe te dienen, waaronder intravitreale (IVT), subretinale, suprachoroïdale, perioculaire of topische toediening. Elke toedieningsweg omvat het overwinnen van barrières zoals de bloed-retinabarrière of de binnenste en buitenste beperkende membranen en heeft verschillende werkzaamheidssnelheden, afhankelijk van het geneesmiddel dat wordt toegediend en het specifieke retinale doel 1,2.
Ivt-medicijnafgifte omvat een injectie in de glasvochthumor van het oog, een gelatineuze substantie die de achterste kamer van het oog inneemt. De primaire functie van het glasvocht is om de vorm van de oogbol te behouden en oculaire weefsels, zoals de lens en het netvlies, op hun plaats te houden. De glasachtige humor bestaat grotendeels uit water, met kleine hoeveelheden collageen, hyaluronzuur en andere niet-koolzuurhoudende eiwitten3. IVT-injectie is een eenvoudige en veel voorkomende procedure die routinematig wordt gebruikt om een breed scala aan oculaire aandoeningen te behandelen, waaronder leeftijdsgebonden maculaire degeneratie, diabetisch macula-oedeem, diabetische retinopathie, retinale ader occlusie en verschillende erfelijke retinale dystrofieën 4,5.
Neuronale ceroïde lipofuscinoses (NCL; Battenziekte) zijn een groep dodelijke lysosomale stapelingsziekten die ernstige degeneratie van de hersenen en het netvlies veroorzaken. Er zijn momenteel 13 bekende varianten van NCL als gevolg van mutaties in verschillende genen (CLN1-8, CLN10-14) die voornamelijk kinderen treffen, maar verschillende leeftijden van aanvang en ernst van de ziekte hebben6. De NCL’s delen gemeenschappelijke progressieve symptomen, waaronder cognitieve en motorische achteruitgang, epileptische aanvallen en verlies van gezichtsvermogen. Er is geen remedie voor NCL; hersengestuurde enzymvervangingstherapie is momenteel echter in klinische onderzoeken voor CLN2-ziekte 7,8, en AAV-gemedieerde gentherapie is veelbelovend gebleken in preklinische studies, met een klinische proef voor CLN5-gentherapie die naar verwachting in 2022 zal beginnen 9,10.
Veel andere soorten ontwikkelen natuurlijk voorkomende vormen van NCL, waaronder katten, honden, schapen en koeien. Twee schapenmodellen van NCL worden momenteel actief bestudeerd in Nieuw-Zeeland: een CLN5-ziektemodel bij Borderdale-schapen en een CLN6-ziektemodel bij schapen in South Hampshire. Aangetaste schapen vertonen veel van de klinische en pathologische kenmerken van de menselijke ziekte, waaronder retinale atrofie en verlies van gezichtsvermogen 10,11. Hoewel hersengerichte CLN5-gentherapie bij schapen met CLN5-ziekte hersenatrofie en klinische achteruitgang kan voorkomen of stoppen, verliezen de behandelde schapen nog steeds hun gezichtsvermogen9. Dit benadrukte de noodzaak om het netvlies te behandelen om het gezichtsvermogen te behouden en een betere kwaliteit van leven te behouden, wat leidde tot de vaststelling van een protocol voor oculaire gentherapie bij schapen.
Het schapenoog vertegenwoordigt een goed model van het menselijk oog vanwege de gelijkenis in oogbolafmetingen, glasachtig volume en retinale structuur 10,12,13. Dit artikel beschrijft het chirurgische protocol voor ivt-toediening van een klein volume (≤ 100 μL) therapeutische virale vector aan het schapenoog.
Intravitreale injecties zijn een van de meest voorkomende chirurgische procedures in de menselijke oogheelkunde en zijn effectief gebleken bij het leveren van AAV-gemedieerde gentherapieën aan het netvlies van schapen. We hadden eerder de werkzaamheid van AAV9 aangetoond. CLN5-gentherapie intravitreaal toegediend bij het verzwakken van retinale disfunctie en degeneratie bij schapen met CLN5 NCL15. Gehoopt wordt dat de vertaling van deze toedieningsweg naar menselijke NCL-patiënten ook nuttig zal…
The authors have nothing to disclose.
De auteurs willen Dr. Steve Heap (BVSc, CertVOphthal) bedanken voor zijn hulp bij het opstellen van dit protocol en het uitvoeren van de injecties beschreven door Murray et al.15. De auteurs erkennen ook financiering van CureKids New Zealand, de Canterbury Medical Research Foundation, Neurogene Inc en de Batten Disease Support and Research Association.
1 mL low dead-space safety syringe with permanently attached 0.5 inch needle | Fisher Scientific, Auckland, New Zealand | 05-561-28 | Covidien Monoject Tuberculin Safety syringe or similar |
1.5 mL microcentrifuge tube | Sigma Aldrich | HS4323 | Autoclave tubes to sterilise prior to use |
Anesthesia machine with gas bench and monitor | Hyvet Anesthesia, Christchurch, New Zealand | ||
Antibiotic eye drops | Teva Pharma Ltd, Auckland, New Zealand | Commercial name: Chlorafast (0.5% chloramphenicol) | |
BrightMount plus anti-fade mounting medium | Abcam, Cambridge, United Kingdom | ab103748 | |
DAPI (4′ ,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) | Sigma Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | 10236276001 | |
Diazepam sedative | Ilium, Troy Laboratories Pty Ltd, Tauranga, New Zealand | 5 mg/mL | |
Endotracheal tubes | Flexicare Medical Ltd, Mountain Ash, United Kingdom | Standard, cuffed. Sizes 7, 7.5, or 8 depending on sheep size | |
Eye speculum | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | KP151/14 | Nopa Barraquer-Colibri (10 mm) |
Fenestrated surgical drape | Amtech Medical Ltd, Whanganui, New Zealand | DI583 | Or similar |
Filter Tips | Interlab, Auckland, New Zealand | 10, 200, and 1,000 µL | |
Formaldehyde solution (37%) | Fisher Scientific, Auckland, New Zealand | AJA809-2.5PL | Make up to 10% in distilled water with 0.9% NaCl |
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 594 | Invitrogen Carlsbad, CA, USA | A-11012 | Use at a dilution of 1:500 |
Isoflurane anesthetic | Attane, Bayer Animal Health, Auckland, New Zealand | ||
Ketamine HCl anesthetic/analgesic | PhoenixPharm Distributors Ltd, Auckland, New Zealand | 100 mg/mL | |
Laryngoscope (veterinary) | KaWe Medical, Denmark | Miller C blade, size 2 | |
Needles | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | 302025 | BD Hypodermic Needles, or similar |
Non-steroidal anti-inflammatory | Boehringer Ingelheim (NZ) Ltd, Auckland, New Zealand | 49402/008 | Commercial name: Metacam 20 (20 mg/mL meloxicam) |
Non-toothed forceps | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | AB864/16 | Or similar |
Non-toothed hemostat | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | AA150/12 | Or similar |
Normal goat serum | Thermo Fisher Scientific, Christchurch, New Zealand | 16210072 | |
Oxygen (medical) | BOC Gas, Christchurch, New Zealand | D2 cylinder, gas code 180 | |
Phosphate buffered saline | Thermo Fisher Scientific, Christchurch, New Zealand | 10010023 | Sterile, filtered |
Povidone-Iodine solution | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | 005835 | Commercial name: Betadine (10% povidone-iodine) |
Rabbit anti-cow glial fibrillary acidic protein (GFAP) | Dako, Glostrup, Denmark | Z0334 | Use at a dilution of 1:2,500 |
Self-complementary adeno-associated virus serotype 9, containing the chicken beta action (CBh) promoter and codon-optimized ovine CLN5 | University of North Carolina Vector Core, NC, USA. | scAAV9/CBh-oCLN5opt | |
Sodium Chloride 0.9% IV Solution | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | AHB1322 | Commercial name: Saline solution |
Subcutaneous antibiotics | Intervet Schering Plough Animal Health Ltd, Wellington, New Zealand | Commercial name: Duplocillin LA (150,000 IU/mL procaine penicillin and 115,000 IU/mL benzathine penicillin) | |
Surgical sharp blunt curved scissors | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | SSSHBLC130 | |
Terumo Syringe Luer Lock | Amtech Medical Ltd, Whanganui, New Zealand | SH159/SH160 | Sterile syringes; 10 mL for drawing up induction drugs, 20 mL for drawing up saline |
Virkon Disinfectant Powder | EBOS Group Ltd, Christchurch, NZ | 28461115 |