Isolamento di lisati proteici a cellule intere da processi facciali di topo e cellule mesenchimali palatali coltivate per l'analisi delle fosfoproteine
Summary
Il protocollo presenta un metodo per isolare lisati proteici di cellule intere da processi facciali embrionali di topo sezionati o cellule mesenchimali palatali embrionali di topo in coltura ed eseguire il successivo western blotting per valutare i livelli di proteine fosforilate.
Abstract
Lo sviluppo craniofacciale dei mammiferi è un processo morfologico complesso durante il quale più popolazioni cellulari si coordinano per generare lo scheletro frontonasale. Questi cambiamenti morfologici sono iniziati e sostenuti attraverso diverse interazioni di segnalazione, che spesso includono la fosforilazione proteica da parte delle chinasi. Qui vengono forniti due esempi di contesti fisiologicamente rilevanti in cui studiare la fosforilazione delle proteine durante lo sviluppo craniofacciale dei mammiferi: i processi facciali del topo, in particolare i processi mascellari E11.5, e le cellule mesenchimali palatali embrionali embrionali di topo in coltura derivate da scaffali palatali secondari E13.5. Per superare la barriera comune della defosforilazione durante l’isolamento proteico, vengono discussi gli adattamenti e le modifiche ai metodi di laboratorio standard che consentono l’isolamento delle fosfoproteine. Inoltre, vengono fornite le migliori pratiche per un’analisi e una quantificazione adeguate delle fosfoproteine a seguito del western blotting dei lisati proteici di cellule intere. Queste tecniche, in particolare in combinazione con inibitori farmacologici e/o modelli genetici murini, possono essere utilizzate per ottenere una maggiore comprensione delle dinamiche e dei ruoli di varie fosfoproteine attive durante lo sviluppo craniofacciale.
Introduction
Lo sviluppo craniofacciale dei mammiferi è un processo morfologico complesso durante il quale più popolazioni cellulari si coordinano per generare lo scheletro frontonasale. Nel topo, questo processo inizia al giorno embrionale (E) 9.5 con la formazione della prominenza frontonasale e coppie di processi mascellari e mandibolari, ognuno dei quali contiene cellule della cresta neurale cranica post-migratoria. I processi nasali laterali e mediali derivano dalla prominenza frontonasale con la comparsa delle fosse nasali e alla fine si fondono per formare le narici. Inoltre, i processi nasali mediali e i processi mascellari si fondono per generare il labbro superiore. Allo stesso tempo, la palatogenesi viene avviata con la formazione di escrescenze distinte – gli scaffali palatali secondari – dal lato orale dei processi mascellari a E11.5. Nel corso del tempo, i ripiani palatali crescono verso il basso su entrambi i lati della lingua, si elevano in una posizione opposta sopra la lingua e alla fine si fondono sulla linea mediana per formare un palato continuo che separa le cavità nasali e orali da E16.51.
Questi cambiamenti morfologici durante lo sviluppo craniofacciale sono iniziati e sostenuti attraverso diverse interazioni di segnalazione, che spesso includono la fosforilazione proteica da parte delle chinasi. Ad esempio, i recettori della membrana cellulare, come le sottofamiglie di recettori del fattore di crescita trasformante (TGF)-β, compresi i recettori delle proteine morfogenetiche ossee (BMMR) e varie famiglie di tirosin-chinasi (RTK), sono autofosforilati dopo il legame del ligando e l’attivazione nelle cellule della cresta neurale cranica 2,3,4 . Inoltre, il recettore transmembrana accoppiato alla proteina G Smoothened diventa fosforilato nelle cellule della cresta neurale cranica e nell’ectoderma craniofacciale a valle del ligando Sonic hedgehog (SHH) che si lega al recettore Patched1, con conseguente accumulo smoothened alla membrana ciliare e attivazione della via SHH5. Tali interazioni ligando-recettore possono avvenire attraverso la segnalazione autocrina, paracrina e/o juxtacrine in contesti craniofacciali. Ad esempio, BMP6 è noto per segnalare in modo autocrino durante la differenziazione dei condrociti6, mentre il fattore di crescita dei fibroblasti (FGF) 8 è espresso nell’ectoderma dell’arco faringeo e si lega ai membri della famiglia FGF di RTK espressi nel mesenchima dell’arco faringeo in modo paracrino per avviare il patterning e la crescita degli archi faringei7, 8,9,10. Inoltre, la segnalazione di Notch viene attivata sia nei condrociti che negli osteoblasti durante lo sviluppo scheletrico craniofacciale attraverso la segnalazione juxtacrine quando i ligandi Delta transmembrana e/o Jagged si legano ai recettori Notch transmembrana sulle cellule vicine, che vengono successivamente scissi e fosforilati11. Tuttavia, ci sono altre coppie di ligando e recettori importanti per lo sviluppo craniofacciale che hanno la flessibilità di funzionare sia nella segnalazione autocrina che paracrina. Ad esempio, durante la morfogenesi dei denti murini, è stato dimostrato che il ligando del fattore di crescita derivato dalle piastrine (PDGF)-AA segnala in modo autocrino l’attivazione del PDGFRα RTK nell’epitelio12 dell’organo dello smalto. Al contrario, nei processi facciali murini durante la gestazione media, i trascritti che codificano i ligandi PDGF-AA e PDGF-CC sono espressi nell’ectoderma craniofacciale, mentre il recettore PDGFRα è espresso nel mesenchima derivato dalla cresta neurale cranica sottostante, con conseguente segnalazione paracrina 13,14,15,16,17 . Indipendentemente dal meccanismo di segnalazione, questi eventi di fosforilazione del recettore spesso provocano il reclutamento di proteine adattatrici e/o molecole di segnalazione, che spesso si fosforilano per avviare cascate di chinasi intracellulari come la via della chinasi proteica attivata dai mitogeni (MAPK)18,19.
Gli effettori intracellulari terminali di queste cascate possono quindi fosforilare una serie di substrati, come fattori di trascrizione, legame con l’RNA, proteine della matrice citoscheletrica ed extracellulare. Runx220, Hand121, Dlx3/5 22,23,24, Gli1-3 25 e Sox926 sono tra i fattori di trascrizione fosforilati nel contesto dello sviluppo craniofacciale. Questa modifica post-traduzionale (PTM) può influenzare direttamente la suscettibilità a PTM alternativi, dimerizzazione, stabilità, scissione e / o affinità di legame con il DNA, tra le altre attività 20,21,25,26. Inoltre, la proteina legante l’RNA Srsf3 è fosforilata nel contesto dello sviluppo craniofacciale, portando alla sua traslocazione nucleare27. In generale, è stato dimostrato che la fosforilazione delle proteine leganti l’RNA influisce sulla loro localizzazione subcellulare, sulle interazioni proteina-proteina, sul legame con l’RNA e/o sulla specificità della sequenza28. Inoltre, la fosforilazione dell’actomiosina può portare a riarrangiamenti citoscheletrici durante lo sviluppo craniofacciale29,30 e la fosforilazione delle proteine della matrice extracellulare, come le glicoproteine legate al ligando N legate all’integrina, contribuisce alla biomineralizzazione durante lo sviluppo scheletrico31. Attraverso quanto sopra e numerosi altri esempi, è evidente che ci sono ampie implicazioni per la fosforilazione delle proteine durante lo sviluppo craniofacciale. Aggiungendo un ulteriore livello di regolazione, la fosforilazione delle proteine è ulteriormente modulata dalle fosfatasi, che contrastano le chinasi rimuovendo i gruppi fosfato.
Questi eventi di fosforilazione sia a livello di recettore che di molecola effettrice sono fondamentali per la propagazione delle vie di segnalazione e alla fine provocano cambiamenti nell’espressione genica nel nucleo, guidando attività cellulari specifiche, come la migrazione, la proliferazione, la sopravvivenza e la differenziazione, che si traducono in una corretta formazione del volto dei mammiferi. Data la specificità del contesto delle interazioni proteiche con chinasi e fosfatasi, i conseguenti cambiamenti nelle PTM e i loro effetti sull’attività cellulare, è fondamentale che questi parametri siano studiati in un contesto fisiologicamente rilevante per ottenere una comprensione completa del contributo degli eventi di fosforilazione allo sviluppo craniofacciale. Qui vengono forniti esempi di due contesti in cui studiare la fosforilazione delle proteine e, quindi, l’attivazione delle vie di segnalazione durante lo sviluppo craniofacciale dei mammiferi: i processi facciali dei topi, in particolare i processi mascellari E11.5, e le cellule mesenchimiche palatali embrionali di topo in coltura derivate da scaffali palatali secondari E13.5 – entrambi primari32 e immortalati33 . A E11.5, i processi mascellari sono in fase di fusione con i processi nasali laterali e mediali1, rappresentando così un punto temporale critico durante lo sviluppo craniofacciale del topo. Inoltre, i processi mascellari e le cellule derivate dagli scaffali palatali sono stati scelti qui perché queste ultime strutture sono derivati delle prime, fornendo così ai ricercatori l’opportunità di interrogare la fosforilazione proteica in vivo e in vitro in contesti correlati. Tuttavia, questo protocollo è applicabile anche a processi facciali alternativi e punti temporali di sviluppo.
Un problema critico nello studio delle proteine fosforilate è che sono facilmente defosforilate durante l’isolamento proteico da abbondanti fosfatasi ambientali. Per superare questa barriera, vengono discussi gli adattamenti e le modifiche ai metodi di laboratorio standard che consentono l’isolamento delle proteine fosforilate. Inoltre, vengono fornite le migliori pratiche per un’analisi e una quantificazione adeguate delle proteine fosforilate. Queste tecniche, in particolare in combinazione con inibitori farmacologici e/o modelli genetici murini, possono essere utilizzate per ottenere una maggiore comprensione delle dinamiche e dei ruoli delle varie vie di segnalazione attive durante lo sviluppo craniofacciale.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo qui descritto consente ai ricercatori di sondare eventi critici di segnalazione dipendenti dalla fosforilazione durante lo sviluppo craniofacciale in modo robusto e riproducibile. Ci sono diversi passaggi critici in questo protocollo che garantiscono una corretta raccolta di dati e l’analisi dei risultati. Che si tratti di isolare le fosfoproteine dai processi facciali dei topi e / o dalle cellule mesenchimali palatali in coltura, è imperativo muoversi in modo rapido ed efficiente mantenendo tutti i reagen…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
129S4 topi sono stati un dono del Dr. Philippe Soriano, Icahn School of Medicine del Monte Sinai. Questo lavoro è stato sostenuto con fondi dal National Institutes of Health (NIH) / National Institute of Dental and Craniofacial Research (NIDCR) R01 DE027689 e K02 DE028572 a K.A.F., F31 DE029976 a M.A.R. e F31 DE029364 a B.J.C.D.
Materials
| Equipment | |||
| Block for mini dry bath | Research Products International Corp | 400783 | |
| ChemiDoc XRS+ imaging system with Image Lab software | Bio-Rad | 1708265 | chemiluminescence imager |
| CO2 incubator, air jacket | VWR | 10810-902 | |
| Dissecting board, 11 x 13 in | Fisher Scientific | 09 002 12 | |
| Electrophoresis cell, 4-gel, for mini precast gels with mini trans-blot module | Bio-Rad | 1658030 | |
| Hybridization oven | Fisher Scientific | UVP95003001 | |
| Microcentrifuge 5415 D with F45-24-11 rotor (Eppendorf) | Sigma Aldrich | Z604062 | |
| Mini dry bath | Research Products International Corp | 400780 | |
| Orbital shaker | VWR | 89032-092 | |
| pH meter | VWR | 89231-662 | |
| Power supply for SDS-PAGE | Bio-Rad | 1645050 | |
| Rectangular ice pan, maxi 9 L | Fisher Scientific | 07-210-093 | |
| Stemi 508 stereo microscope with stand K LAB, LED ring light | Zeiss | 4350649020000000 | dissecting microscope |
| Timer | VWR | 62344-641 | |
| Tube revolver | Fisher Scientific | 11 676 341 | |
| Vortex mixer | Fisher Scientific | 02 215 414 | |
| Water bath | VWR | 89501-472 | |
| Western blot box | Fisher Scientific | NC9358182 | |
| Materials | |||
| Cell culture dishes, 6 cm | Fisher Scientific | 12-565-95 | |
| Cell culture plates, 12 well | Fisher Scientific | 07-200-82 | |
| Cell lifters | Fisher Scientific | 08-100-240 | |
| CO2 | Airgas | CD USP50 | |
| Conical tubes, polypropylene, 50 mL | Fisher Scientific | 05-539-13 | |
| Dumont #5 fine forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Embryo spoon | Fine Science Tools | 10370-17 | |
| Microcentrifuge tubes, 0.5 mL | VWR | 89000-010 | |
| Microcentrifuge tubes, 1.5 mL | VWR | 20170-038 | |
| Pasteur pipet, 5.75" | Fisher Scientific | 13-678-6A | |
| Pasteur pipet, 9" | VWR | 14672-380 | |
| Petri dishes, 10 cm | Fisher Scientific | 08-757-100D | |
| Petri dishes, 35 mm | Fisher Scientific | FB0875711YZ | |
| Pouches, transparent, polyethylene lining | Fisher Scientific | 01-812-25B | |
| PVDF membrane | Fisher Scientific | IPVH00010 | |
| Semken forceps | Fine Science Tools | 11008-13 | |
| Small latex bulb, 2 mL | VWR | 82024-554 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 14002-12 | |
| Syringe filter, 25 mm, 0.2 μm pore size | Fisher Scientific | 09-740-108 | |
| Syringe with luer tip, 10 mL | VWR | BD309604 | |
| Transfer pipet | Fisher Scientific | 13-711-22 | |
| Western blot cassette opening lever | Bio-Rad | 4560000 | |
| Whatmann 3MM chr chromatography paper | Fisher Scientific | 05-714-5 | |
| Reagents | |||
| 4-15% Precast protein gels, 10-well, 30 µL | Bio-Rad | 4561083 | |
| β-glycerophosphate disodium salt hydrate | Sigma Aldrich | G5422-25G | stock concentration 1 M |
| β-mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M3148-100ML | |
| Bovine serum albumin, fraction V, heat shock tested | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| Bromophenol blue | Fisher Scientific | AC403140050 | |
| Complete mini protease inhibitor cocktail | Sigma Aldrich | 11836153001 | stock concentration 25x |
| DC protein assay kit II | Bio-Rad | 500-0112 | |
| DMEM, high glucose | Gibco | 11965092 | |
| E7, mouse monoclonal beta tubulin primary antibody, concentrate 0.1 mL | Developmental Studies Hybridoma Bank | E7 | 1:1,000 |
| ECL western blotting substrate | Fisher Scientific | PI32106 | low picogram range |
| ECL western blotting substrate | Genesee Scientific | 20-302B | low femtogram range |
| Electrophoresis buffer, 5 L | Bio-Rad | 1610772 | stock concentration 10x |
| Ethanol, 200 proof, 1 gallon | Decon Laboratories, Inc. | 2705HC | EtOH |
| Ethylenediaminetetraacetic acid, Di Na salt dihydr. (crystalline powd./electrophor.) | Fisher Scientific | BP120-500 | EDTA |
| Fetal bovine serum, characterized, US origin, 500 mL | HyClone | SH30071.03 | |
| Glycerol (certified ACS) | Fisher Scientific | G33-4 | |
| HRP-conjugated secondary antibody, goat anti-mouse IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 115-035-146 | 1:20,000 |
| HRP-conjugated secondary antibody, goat anti-rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 111-035-003 | 1:20,000 |
| Hydrochloric acid solution, 6N (certified) | Fisher Scientific | SA56-500 | HCl |
| Igepal Ca – 630 non-ionic detergent | Fisher Scientific | ICN19859650 | Nonidet P-40 |
| Isopropanol (HPLC) | Fisher Scientific | A451-1 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030081 | stock concentration 200 mM |
| Methanol | Fisher Scientific | A454-4 | |
| p44/42 MAPK (Erk1/2) primary antibody | Cell Signaling Technology | 9102S | 1:1,000; anti-Erk1/2 |
| PDGF-BB recombinant ligand, rat | Fisher Scientific | 520BB050 | |
| PDGF Receptor β primary antibody | Cell Signaling Technology | 3169S | 1:1,000 |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | stock concentration 100 U/mL, 100 µg/mL |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride, 99% | Fisher Scientific | AC215740100 | PMSF; stock concentration 100 mM |
| Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) primary antibody | Cell Signaling Technology | 9101S | 1:1,000, anti-phospho-Erk1/2 |
| Phospho-PDGF Receptor α /PDGF Receptor β primary antibody | Cell Signaling Technology | 3170S | 1:1,000 |
| Potassium chloride (white crystals) | Fisher Scientific | BP366-500 | KCl |
| Potassium phosphate monobasic (white crystals) | Fisher Scientific | BP362-500 | KH2PO4 |
| SDS solution, 10% | Bio-Rad | 161-0416 | |
| Sodium chloride (crystalline/biological,certified) | Fisher Scientific | S671-3 | NaCl |
| Sodium fluoride (powder/certified ACS) | Fisher Scientific | S299-100 | NaF; aliquot for one time use; stock concentration 1 M |
| Sodium orthovanadate, 99% | Fisher Scientific | AC205330500 | Na3VO4; stock concentration 100 mM |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous (granular or powder/certified ACS) | Fisher Scientific | S374-500 | Na2HPO4 |
| Tissue culture PBS | Fisher Scientific | 21-031-CV | |
| Transfer buffer, 5 L | Bio-Rad | 1610771 | stock concentration 10x |
| Tris base (white crystals or crystalline powder/molecular biology) | Fisher Scientific | BP152-1 | |
| Trypsin | BioWorld | 21560033 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Western blot molecular weight marker | Bio-Rad | 1610374 | |
| Software | |||
| ImageJ software | National Institutes of Health | ||
| Animals | |||
| Female 129S4 mice | gift of Dr. Philippe Soriano, Icahn School of Medicine at Mount Sinai |
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