JoVE Journal > Developmental Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
자동 번역
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
발생학

Isolatie van hele celproteïnelysaten uit gezichtsprocessen van muizen en gekweekte palatale mesenchymcellen voor fosfoproteïne-analyse

Published: April 01, 2022
doi:
10.3791/63834
, ,
1Department of Craniofacial Biology, School of Dental Medicine,University of Colorado Anschutz Medical Campus

Summary

Het protocol presenteert een methode voor het isoleren van hele cel eiwitlysaten van ontleedde muis embryo gezichtsprocessen of gekweekte muis embryonale palatale mesenchym cellen en het uitvoeren van daaropvolgende western blotting om gefosforyleerde eiwitniveaus te beoordelen.

Abstract

Craniofaciale ontwikkeling bij zoogdieren is een complex morfologisch proces waarbij meerdere celpopulaties coördineren om het frontonasale skelet te genereren. Deze morfologische veranderingen worden geïnitieerd en in stand gehouden door verschillende signaalinteracties, waaronder vaak eiwitfosforylering door kinasen. Hier worden twee voorbeelden gegeven van fysiologisch relevante contexten waarin fosforylering van eiwitten tijdens de craniofaciale ontwikkeling van zoogdieren kan worden bestudeerd: gezichtsprocessen van muizen, in het bijzonder E11.5 maxillaire processen, en gekweekte embryonale palatale mesenchymcellen van muizen afgeleid van E13.5 secundaire palatale planken. Om de gemeenschappelijke barrière van defosforylering tijdens eiwitisolatie te overwinnen, worden aanpassingen en wijzigingen aan standaard laboratoriummethoden besproken die isolatie van fosfoproteïnen mogelijk maken. Daarnaast worden best practices verstrekt voor een goede analyse en kwantificering van fosfoproteïnen na western blotting van hele cel eiwitlysaten. Deze technieken, met name in combinatie met farmacologische remmers en/of murine genetische modellen, kunnen worden gebruikt om meer inzicht te krijgen in de dynamiek en rollen van verschillende fosfoproteïnen die actief zijn tijdens craniofaciale ontwikkeling.

Introduction

Craniofaciale ontwikkeling bij zoogdieren is een complex morfologisch proces waarbij meerdere celpopulaties coördineren om het frontonasale skelet te genereren. Bij de muis begint dit proces op embryonale dag (E) 9,5 met de vorming van de frontonasale prominentie en paren van maxillaire en mandibulaire processen, die elk post-migrerende craniale neurale crestcellen bevatten. De laterale en mediale nasale processen ontstaan uit de frontonasale prominentie met het verschijnen van de neusputten en smelten uiteindelijk samen tot de neusgaten. Verder smelten de mediale neusprocessen en maxillaire processen samen om de bovenlip te genereren. Tegelijkertijd wordt palatogenese geïnitieerd met de vorming van verschillende uitwassen – de secundaire palatale planken – van de orale kant van de maxillaire processen bij E11.5. Na verloop van tijd groeien de palatale planken aan weerszijden van de tong naar beneden, verheffen zich tot een tegengestelde positie boven de tong en smelten uiteindelijk samen aan de middellijn om een continu gehemelte te vormen dat de neus- en mondholten scheidt door E16.51.

Deze morfologische veranderingen gedurende de craniofaciale ontwikkeling worden geïnitieerd en ondersteund door verschillende signaalinteracties, waaronder vaak eiwitfosforylatie door kinasen. Celmembraanreceptoren, zoals subfamilies van transformerende groeifactor (TGF)-β receptoren, waaronder botmorfogenetische eiwitreceptoren (BMPRs) en verschillende receptor tyrosinekinase (RTK) families, worden bijvoorbeeld autofosforyleerd op ligandbinding en activering in craniale neurale crestcellen 2,3,4 . Bovendien wordt de G-eiwit-gekoppelde transmembraanreceptor Smoothened gefosforyleerd in craniale neurale crestcellen en craniofacial ectoderm stroomafwaarts van Sonic hedgehog (SHH) ligandbinding aan de Patched1-receptor, wat resulteert in gladgestreken accumulatie op het ciliaire membraan en SHH-routeactivering5. Dergelijke ligand-receptor interacties kunnen optreden via autocriene, paracriene en / of juxtacrine signalering in craniofaciale contexten. Van BMP6 is bijvoorbeeld bekend dat het op een autocriene manier signaleert tijdens chondrocytendifferentiatie6, terwijl fibroblastgroeifactor (FGF) 8 wordt uitgedrukt in het faryngeale boogectoderm en bindt aan leden van de FGF-familie van RTK’s uitgedrukt in het faryngeale boogmes mesenchym op een paracriene manier om patroonvorming en uitgroei van de faryngeale bogen te initiëren7, 8,9,10. Bovendien wordt Notch-signalering geactiveerd in zowel chondrocyten als osteoblasten tijdens craniofaciale skeletontwikkeling door juxtacrine-signalering wanneer transmembraandelta en / of gekartelde liganden binden aan transmembraan Notch-receptoren op naburige cellen, die vervolgens worden gesplitst en gefosforyleerd11. Er zijn echter andere ligand- en receptorparen die belangrijk zijn voor craniofaciale ontwikkeling die de flexibiliteit hebben om te functioneren in zowel autocriene als paracriene signalering. Tijdens morfogenese van muizentanden is bijvoorbeeld aangetoond dat van bloedplaatjes afgeleide groeifactor (PDGF)-AA-ligand op een autocriene manier signaleert om de RTK PDGFRα in het glazuurorgaanepitheelte activeren 12. Daarentegen worden bij muriene gezichtsprocessen tijdens de zwangerschap transcripten die coderen voor de liganden PDGF-AA en PDGF-CC uitgedrukt in het craniofaciale ectoderm, terwijl de PDGFRα-receptor wordt uitgedrukt in het onderliggende craniale neurale crest-afgeleide mesenchym, wat resulteert in paracriene signalering 13,14,15,16,17 . Ongeacht het signaleringsmechanisme resulteren deze receptorfosforylatiegebeurtenissen vaak in de rekrutering van adaptoreiwitten en / of signaalmoleculen, die vaak zelf gefosforyleerd worden om intracellulaire kinasecascades te initiëren, zoals de mitogeen-geactiveerde eiwitkinase (MAPK) -route18,19.

De terminale intracellulaire effectoren van deze cascades kunnen vervolgens een reeks substraten fosforyleren, zoals transcriptiefactoren, RNA-binding, cytoskeletale en extracellulaire matrixeiwitten. Runx220, Hand121, Dlx3/5 22,23,24, Gli1-3 25 en Sox926 behoren tot de transcriptiefactoren die gefosforyleerd zijn in de context van craniofaciale ontwikkeling. Deze posttranslationele modificatie (PTM) kan direct van invloed zijn op de gevoeligheid voor alternatieve PTM’s, dimerisatie, stabiliteit, splitsing en/of DNA-bindende affiniteit, naast andere activiteiten 20,21,25,26. Bovendien wordt het RNA-bindende eiwit Srsf3 gefosforyleerd in de context van craniofaciale ontwikkeling, wat leidt tot zijn nucleaire translocatie27. Over het algemeen is aangetoond dat fosforylering van RNA-bindende eiwitten hun subcellulaire lokalisatie, eiwit-eiwitinteracties, RNA-binding en / of sequentiespecificiteitbeïnvloedt 28. Bovendien kan fosforylering van actomyosine leiden tot cytoskeletale herschikkingen gedurende de craniofaciale ontwikkeling29,30, en fosforylering van extracellulaire matrixeiwitten, zoals kleine integrinebindende ligand N-gebonden glycoproteïnen, draagt bij aan biomineralisatie tijdens de ontwikkeling van het skelet31. Door het bovenstaande en tal van andere voorbeelden is het duidelijk dat er brede implicaties zijn voor eiwitfosforylering tijdens craniofaciale ontwikkeling. Door een extra niveau van regulatie toe te voegen, wordt eiwitfosforylering verder gemoduleerd door fosfatasen, die kinasen tegengaan door fosfaatgroepen te verwijderen.

Deze fosforyleringsgebeurtenissen op zowel het receptor- als effectormolecuulniveau zijn van cruciaal belang voor de voortplanting van signaalroutes en resulteren uiteindelijk in veranderingen in genexpressie in de kern, waardoor specifieke celactiviteiten worden aangedreven, zoals migratie, proliferatie, overleving en differentiatie, die resulteren in de juiste vorming van het zoogdiergezicht. Gezien de contextspecificiteit van eiwitinteracties met kinasen en fosfatasen, de resulterende veranderingen in PTM’s en hun effecten op celactiviteit, is het van cruciaal belang dat deze parameters worden bestudeerd in een fysiologisch relevante omgeving om volledig inzicht te krijgen in de bijdrage van fosforyleringsgebeurtenissen aan craniofaciale ontwikkeling. Hier worden voorbeelden gegeven van twee contexten waarin fosforylering van eiwitten en dus activering van signaalroutes tijdens de craniofaciale ontwikkeling van zoogdieren moet worden bestudeerd: gezichtsprocessen van muizen, in het bijzonder E11,5 maxillaire processen, en gekweekte embryonale palatale mesenchymcellen van muizen afgeleid van E13.5 secundaire palatale planken – zowel primaire32 als vereeuwigde33 . Bij E11.5 zijn de maxillaire processen in het proces van versmelting met de laterale en mediale nasale processen1, waardoor een kritisch tijdspunt wordt weergegeven tijdens de craniofaciale ontwikkeling van de muis. Verder werden hier maxillaire processen en cellen afgeleid van de palatale planken gekozen omdat de laatste structuren derivaten zijn van de eerste, waardoor onderzoekers de mogelijkheid krijgen om eiwitfosforylatie in vivo en in vitro in gerelateerde contexten te ondervragen. Dit protocol is echter ook van toepassing op alternatieve gezichtsprocessen en ontwikkelingstijdpunten.

Een cruciaal probleem bij het bestuderen van gefosforyleerde eiwitten is dat ze gemakkelijk worden gedefosforyleerd tijdens eiwitisolatie door overvloedige omgevingsfosfatasen. Om deze barrière te overwinnen, worden aanpassingen en aanpassingen aan standaard laboratoriummethoden besproken die isolatie van gefosforyleerde eiwitten mogelijk maken. Daarnaast worden best practices gegeven voor een goede analyse en kwantificering van gefosforyleerde eiwitten. Deze technieken, met name in combinatie met farmacologische remmers en/of muriene genetische modellen, kunnen worden gebruikt om meer inzicht te krijgen in de dynamiek en rollen van verschillende signaalroutes die actief zijn tijdens de craniofaciale ontwikkeling.

Protocol

Alle procedures met betrekking tot dieren werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de University of Colorado Anschutz Medical Campus en uitgevoerd in overeenstemming met institutionele richtlijnen en voorschriften. Vrouwelijke 129S4-muizen op een leeftijd van 1,5-6 maanden en gehuisvest bij een subthermoneutrale temperatuur van 21-23 ° C werden gebruikt voor embryo-oogsten. Een schematische workflow van het protocol is weergegeven in figuur 1. Zie d…

Representative Results

Bij pogingen om de fosforylering van eiwitten geïsoleerd uit gezichtsprocessen van muizen en/of gekweekte palatale mesenchymcellen te karakteriseren, zullen de representatieve resultaten idealiter een duidelijke, reproduceerbare band onthullen na western blotting met een antifosfoproteïne-antilichaam dat op of nabij de hoogte van de overeenkomstige totale eiwitband loopt (figuur 3 ). Als er echter uitgebreide fosforylering van het eiwit optreedt, kan er een lichte opwaartse verschuiving va…

Discussion

Het hier beschreven protocol stelt onderzoekers in staat om kritische fosforyleringsafhankelijke signaleringsgebeurtenissen tijdens craniofaciale ontwikkeling op een robuuste en reproduceerbare manier te onderzoeken. Er zijn verschillende kritieke stappen in dit protocol die zorgen voor een goede verzameling van gegevens en analyse van resultaten. Of het nu gaat om het isoleren van fosfoproteïnen van gezichtsprocessen van muizen en / of gekweekte palatale mesenchymcellen, het is noodzakelijk om snel en efficiënt te bew…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

129S4 muizen waren een geschenk van Dr. Philippe Soriano, Icahn School of Medicine op de berg Sinaï. Dit werk werd ondersteund met fondsen van de National Institutes of Health (NIH) / National Institute of Dental and Craniofacial Research (NIDCR) R01 DE027689 en K02 DE028572 tot K.A.F., F31 DE029976 tot M.A.R. en F31 DE029364 tot B.J.C.D.

Materials

Equipment
Block for mini dry bath Research Products International Corp 400783
ChemiDoc XRS+ imaging system with Image Lab software Bio-Rad 1708265 chemiluminescence imager
CO2 incubator, air jacket VWR 10810-902
Dissecting board, 11 x 13 in Fisher Scientific 09 002 12
Electrophoresis cell, 4-gel, for mini precast gels with mini trans-blot module Bio-Rad 1658030
Hybridization oven Fisher Scientific UVP95003001
Microcentrifuge 5415 D with F45-24-11 rotor (Eppendorf) Sigma Aldrich Z604062
Mini dry bath Research Products International Corp 400780
Orbital shaker VWR 89032-092
pH meter VWR 89231-662
Power supply for SDS-PAGE Bio-Rad 1645050
Rectangular ice pan, maxi 9 L Fisher Scientific 07-210-093
Stemi 508 stereo microscope with stand K LAB, LED ring light Zeiss 4350649020000000 dissecting microscope
Timer VWR 62344-641
Tube revolver Fisher Scientific 11 676 341
Vortex mixer Fisher Scientific 02 215 414
Water bath VWR 89501-472
Western blot box Fisher Scientific NC9358182
Materials
Cell culture dishes, 6 cm Fisher Scientific 12-565-95
Cell culture plates, 12 well Fisher Scientific 07-200-82
Cell lifters Fisher Scientific 08-100-240
CO2 Airgas CD USP50
Conical tubes, polypropylene, 50 mL Fisher Scientific 05-539-13
Dumont #5 fine forceps Fine Science Tools 11254-20
Embryo spoon Fine Science Tools 10370-17
Microcentrifuge tubes, 0.5 mL VWR 89000-010
Microcentrifuge tubes, 1.5 mL VWR 20170-038
Pasteur pipet, 5.75" Fisher Scientific 13-678-6A
Pasteur pipet, 9" VWR 14672-380
Petri dishes, 10 cm Fisher Scientific 08-757-100D
Petri dishes, 35 mm Fisher Scientific FB0875711YZ
Pouches, transparent, polyethylene lining Fisher Scientific 01-812-25B
PVDF membrane Fisher Scientific IPVH00010
Semken forceps Fine Science Tools 11008-13
Small latex bulb, 2 mL VWR 82024-554
Surgical scissors Fine Science Tools 14002-12
Syringe filter, 25 mm, 0.2 μm pore size Fisher Scientific 09-740-108
Syringe with luer tip, 10 mL VWR BD309604
Transfer pipet Fisher Scientific 13-711-22
Western blot cassette opening lever Bio-Rad 4560000
Whatmann 3MM chr chromatography paper Fisher Scientific 05-714-5
Reagents
4-15% Precast protein gels, 10-well, 30 µL Bio-Rad 4561083
β-glycerophosphate disodium salt hydrate Sigma Aldrich G5422-25G stock concentration 1 M
β-mercaptoethanol Sigma Aldrich M3148-100ML
Bovine serum albumin, fraction V, heat shock tested Fisher Scientific BP1600-100
Bromophenol blue Fisher Scientific AC403140050
Complete mini protease inhibitor cocktail Sigma Aldrich 11836153001 stock concentration 25x
DC protein assay kit II Bio-Rad 500-0112
DMEM, high glucose Gibco 11965092
E7, mouse monoclonal beta tubulin primary antibody, concentrate 0.1 mL Developmental Studies Hybridoma Bank E7 1:1,000
ECL western blotting substrate Fisher Scientific PI32106 low picogram range
ECL western blotting substrate Genesee Scientific 20-302B low femtogram range
Electrophoresis buffer, 5 L Bio-Rad 1610772 stock concentration 10x
Ethanol, 200 proof, 1 gallon Decon Laboratories, Inc. 2705HC EtOH
Ethylenediaminetetraacetic acid, Di Na salt dihydr. (crystalline powd./electrophor.) Fisher Scientific BP120-500 EDTA
Fetal bovine serum, characterized, US origin, 500 mL HyClone SH30071.03
Glycerol (certified ACS) Fisher Scientific G33-4
HRP-conjugated secondary antibody, goat anti-mouse IgG Jackson ImmunoResearch Laboratories 115-035-146 1:20,000
HRP-conjugated secondary antibody, goat anti-rabbit IgG Jackson ImmunoResearch Laboratories 111-035-003 1:20,000
Hydrochloric acid solution, 6N (certified) Fisher Scientific SA56-500 HCl
Igepal Ca – 630 non-ionic detergent Fisher Scientific ICN19859650 Nonidet P-40
Isopropanol (HPLC) Fisher Scientific A451-1
L-glutamine Gibco 25030081 stock concentration 200 mM
Methanol Fisher Scientific A454-4
p44/42 MAPK (Erk1/2) primary antibody Cell Signaling Technology 9102S 1:1,000; anti-Erk1/2
PDGF-BB recombinant ligand, rat Fisher Scientific 520BB050
PDGF Receptor β primary antibody Cell Signaling Technology 3169S 1:1,000
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122 stock concentration 100 U/mL, 100 µg/mL
Phenylmethanesulfonyl fluoride, 99% Fisher Scientific AC215740100 PMSF; stock concentration 100 mM
Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) primary antibody Cell Signaling Technology 9101S 1:1,000, anti-phospho-Erk1/2
Phospho-PDGF Receptor α /PDGF Receptor β primary antibody Cell Signaling Technology 3170S 1:1,000
Potassium chloride (white crystals) Fisher Scientific BP366-500 KCl
Potassium phosphate monobasic (white crystals) Fisher Scientific BP362-500 KH2PO4
SDS solution, 10% Bio-Rad 161-0416
Sodium chloride (crystalline/biological,certified) Fisher Scientific S671-3 NaCl
Sodium fluoride (powder/certified ACS) Fisher Scientific S299-100 NaF; aliquot for one time use; stock concentration 1 M
Sodium orthovanadate, 99% Fisher Scientific AC205330500 Na3VO4; stock concentration 100 mM
Sodium phosphate dibasic anhydrous (granular or powder/certified ACS) Fisher Scientific S374-500 Na2HPO4
Tissue culture PBS Fisher Scientific 21-031-CV
Transfer buffer, 5 L Bio-Rad 1610771 stock concentration 10x
Tris base (white crystals or crystalline powder/molecular biology) Fisher Scientific BP152-1
Trypsin BioWorld 21560033
Tween 20 Fisher Scientific BP337-500
Western blot molecular weight marker Bio-Rad 1610374
Software
ImageJ software National Institutes of Health
Animals
Female 129S4 mice gift of Dr. Philippe Soriano, Icahn School of Medicine at Mount Sinai
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bush, J. O., Jiang, R. Palatogenesis: morphogenetic and molecular mechanisms of secondary palate development. Development. 139 (2), 231-243 (2012).
  2. Chai, Y., Ito, Y., Han, J. TGF-beta signaling and its functional significance in regulating the fate of cranial neural crest cells. Critical Reviews in Oral Biology & Medicine. 14 (2), 78-88 (2003).
  3. Nie, X., Luukko, K., Kettunen, P. BMP signalling in craniofacial development. TheInternational Journal of Developmental Biology. 50 (6), 511-521 (2006).
  4. Fantauzzo, K. A., Soriano, P. Receptor tyrosine kinase signaling: regulating neural crest development one phosphate at a time. Current Topics in Developmental Biology. 111, 135-182 (2015).
  5. Xavier, G. M., et al. Hedgehog receptor function during craniofacial development. 발생학. 415 (2), 198-215 (2016).
  6. Grimsrud, C. D., et al. BMP-6 is an autocrine stimulator of chondrocyte differentiation. Journal of Bone and Mineral Research. 14 (4), 475-482 (1999).
  7. MacArthur, C. A., et al. FGF-8 isoforms activate receptor splice forms that are expressed in mesenchymal regions of mouse development. Development. 121 (11), 3603-3613 (1995).
  8. Tucker, A. S., Yamada, G., Grigoriou, M., Pachnis, V., Sharpe, P. T. Fgf-8 determines rostral-caudal polarity in the first branchial arch. Development. 126 (1), 51-61 (1999).
  9. Trumpp, A., Depew, M. J., Rubenstein, J. L., Bishop, J. M., Martin, G. R. Cre-mediated gene inactivation demonstrates that FGF8 is required for cell survival and patterning of the first branchial arch. Genes & Development. 13 (23), 3136-3148 (1999).
  10. Tabler, J. M., et al. Fuz mutant mice reveal shared mechanisms between ciliopathies and FGF-related syndromes. Developmental Cell. 25 (6), 623-635 (2013).
  11. Pakvasa, M., et al. Notch signaling: Its essential roles in bone and craniofacial development. Genes & Diseases. 8 (1), 8-24 (2021).
  12. Chai, Y., Bringas, P., Mogharei, A., Shuler, C. F., Slavkin, H. C. PDGF-A and PDGFR-alpha regulate tooth formation via autocrine mechanism during mandibular morphogenesis in vitro. Developmental Dynamics. 213 (4), 500-511 (1998).
  13. Morrison-Graham, K., Schatteman, G. C., Bork, T., Bowen-Pope, D. F., Weston, J. A. A PDGF receptor mutation in the mouse (Patch) perturbs the development of a non-neuronal subset of neural crest-derived cells. Development. 115 (1), 133-142 (1992).
  14. Orr-Urtreger, A., Lonai, P. Platelet-derived growth factor-A and its receptor are expressed in separate, but adjacent cell layers of the mouse embryo. Development. 115 (4), 1045-1058 (1992).
  15. Ding, H., et al. The mouse Pdgfc gene: dynamic expression in embryonic tissues during organogenesis. Mechanisms of Development. 96 (2), 209-213 (2000).
  16. Hamilton, T. G., Klinghoffer, R. A., Corrin, P. D., Soriano, P. Evolutionary divergence of platelet-derived growth factor alpha receptor signaling mechanisms. Molecular and Cellular Biology. 23 (11), 4013-4025 (2003).
  17. He, F., Soriano, P. A critical role for PDGFRalpha signaling in medial nasal process development. PLoS Genetics. 9 (9), 1003851 (2013).
  18. Schlessinger, J. Cell signaling by receptor tyrosine kinases. Cell. 103 (2), 211-225 (2000).
  19. Lemmon, M. A., Schlessinger, J. Cell signaling by receptor tyrosine kinases. Cell. 141 (7), 1117-1134 (2010).
  20. Kim, W. J., Shin, H. L., Kim, B. S., Kim, H. J., Ryoo, H. M. RUNX2-modifying enzymes: therapeutic targets for bone diseases. Experimental & Molecular Medicine. 52 (8), 1178-1184 (2020).
  21. Firulli, B. A., Firulli, A. B. Partially penetrant cardiac neural crest defects in Hand1 Phosphomutant mice: Dimer choice that is not so critical. Pediatric Cardiology. 40 (7), 1339-1344 (2019).
  22. Choi, Y. H., Choi, H. J., Lee, K. Y., Oh, J. W. Akt1 regulates phosphorylation and osteogenic activity of Dlx3. Biochemical and Biophysical Research Communications. 425 (4), 800-805 (2012).
  23. Jeong, H. M., et al. Akt phosphorylates and regulates the function of Dlx5. Biochemical and Biophysical Research Communications. 409 (4), 681-686 (2011).
  24. Seo, J. H., et al. Calmodulin-dependent kinase II regulates Dlx5 during osteoblast differentiation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 384 (1), 100-104 (2009).
  25. Gou, Y., Zhang, T., Xu, J. Transcription factors in craniofacial development: From receptor signaling to transcriptional and epigenetic regulation. Current Topics in Developmental Biology. 115, 377-410 (2015).
  26. Schock, E. N., LaBonne, C. Sorting sox: Diverse roles for sox transcription factors during neural crest and craniofacial development. Frontiers in Physiology. 11, 606889 (2020).
  27. Dennison, B. J. C., Larson, E. D., Fu, R., Mo, J., Fantauzzo, K. A. Srsf3 mediates alternative RNA splicing downstream of PDGFRalpha signaling in the facial mesenchyme. Development. 148 (14), (2021).
  28. Stamm, S. Regulation of alternative splicing by reversible protein phosphorylation. Journal of Biological Chemistry. 283 (3), 1223-1227 (2008).
  29. Szabo, A., Mayor, R. Mechanisms of neural crest migration. Annual Review of Genetics. 52, 43-63 (2018).
  30. Kindberg, A. A., Bush, J. O. Cellular organization and boundary formation in craniofacial development. Genesis. 57 (1), 23271 (2019).
  31. Faundes, V., et al. Raine syndrome: an overview. European Journal of Medical Genetics. 57 (9), 536-542 (2014).
  32. Bush, J. O., Soriano, P. Ephrin-B1 forward signaling regulates craniofacial morphogenesis by controlling cell proliferation across Eph-ephrin boundaries. Genes & Development. 24 (18), 2068-2080 (2010).
  33. Fantauzzo, K. A., Soriano, P. Generation of an immortalized mouse embryonic palatal mesenchyme cell line. PLoS One. 12 (6), 0179078 (2017).
  34. Goering, J. P., Isai, D. G., Czirok, A., Saadi, I. Isolation and time-lapse imaging of primary mouse embryonic palatal mesenchyme cells to analyze collective movement attributes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (168), e62151 (2021).
  35. JoVE. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. Science Education Database. , (2022).
  36. . Analyzing gels and western blots with ImageJ Available from: https://lukemiller.og/index.php/2010/11/analyzing-gels-and-western-blots-with-images-j/ (2010)
  37. Fantauzzo, K. A., Soriano, P. PI3K-mediated PDGFRalpha signaling regulates survival and proliferation in skeletal development through p53-dependent intracellular pathways. Genes & Development. 28 (9), 1005-1017 (2014).
  38. Wang, Y., et al. Rapid alteration of protein phosphorylation during postmortem: implication in the study of protein phosphorylation. Scientific Reports. 5, 15709 (2015).
  39. Sharma, S. K., Carew, T. J. Inclusion of phosphatase inhibitors during Western blotting enhances signal detection with phospho-specific antibodies. Analytical Biochemistry. 307 (1), 187-189 (2002).
  40. Bass, J. J., et al. An overview of technical considerations for Western blotting applications to physiological research. Scandinavian Journal of Medicine & Science in Sports. 27 (1), 4-25 (2017).
  41. Hooper, J. E., et al. Systems biology of facial development: contributions of ectoderm and mesenchyme. 발생학. 426 (1), 97-114 (2017).
  42. Childs, C. B., Proper, J. A., Tucker, R. F., Moses, H. L. Serum contains a platelet-derived transforming growth factor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (17), 5312-5316 (1982).
  43. Swaisgood, H. E. Review and update of casein chemistry. Journal of Dairy Science. 76 (10), 3054-3061 (1993).
  44. Silva, J. M., McMahon, M. The fastest Western in town: a contemporary twist on the classic Western blot analysis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (84), e51149 (2014).
  45. Salinovich, O., Montelaro, R. C. Reversible staining and peptide mapping of proteins transferred to nitrocellulose after separation by sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis. Analytical Biochemistry. 156 (2), 341-347 (1986).

Tags

Protein LysatesPhosphoprotein AnalysisFacial ProcessesPalatal Mesenchyme CellsCraniofacial DevelopmentMouse EmbryosProtein IsolationPhosphatase InhibitorsProtein PhosphorylationDissectionCell Culture
check_url/kr/63834?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Rogers, M. A., Dennison, B. J. C., Fantauzzo, K. A. Isolation of Whole Cell Protein Lysates from Mouse Facial Processes and Cultured Palatal Mesenchyme Cells for Phosphoprotein Analysis. J. Vis. Exp. (182), e63834, doi:10.3791/63834 (2022).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image