फॉस्फोप्रोटीन विश्लेषण के लिए माउस चेहरे की प्रक्रियाओं और सुसंस्कृत पैलेटल मेसेंकाइम कोशिकाओं से पूरे सेल प्रोटीन लाइसेट्स का अलगाव
Summary
प्रोटोकॉल विच्छेदित माउस भ्रूण चेहरे की प्रक्रियाओं या सुसंस्कृत माउस भ्रूण तालु मेसेंकाइम कोशिकाओं से पूरे सेल प्रोटीन लाइसेट्स को अलग करने और फॉस्फोरिलेटेड प्रोटीन के स्तर का आकलन करने के लिए बाद में पश्चिमी सोख्ता प्रदर्शन करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करता है।
Abstract
स्तनधारी क्रैनियोफेशियल विकास एक जटिल रूपात्मक प्रक्रिया है जिसके दौरान कई सेल आबादी फ्रंटोनासल कंकाल उत्पन्न करने के लिए समन्वय करती है। इन रूपात्मक परिवर्तनों को विविध सिग्नलिंग इंटरैक्शन के माध्यम से शुरू और निरंतर किया जाता है, जिसमें अक्सर किनेसेस द्वारा प्रोटीन फॉस्फोराइलेशन शामिल होता है। यहां, शारीरिक रूप से प्रासंगिक संदर्भों के दो उदाहरण जिसमें स्तनधारी क्रैनियोफेशियल विकास के दौरान प्रोटीन के फॉस्फोराइलेशन का अध्ययन करने के लिए प्रदान किए जाते हैं: माउस चेहरे की प्रक्रियाएं, विशेष रूप से ई 11.5 मैक्सिलरी प्रक्रियाओं में, और ई 13.5 माध्यमिक तालु अलमारियों से प्राप्त सुसंस्कृत माउस भ्रूण तालु मेसेंकाइमल कोशिकाएं। प्रोटीन अलगाव के दौरान डिफॉस्फोराइलेशन की सामान्य बाधा को दूर करने के लिए, मानक प्रयोगशाला विधियों के अनुकूलन और संशोधनों पर चर्चा की जाती है जो फॉस्फोप्रोटीन के अलगाव की अनुमति देते हैं। इसके अतिरिक्त, पूरे सेल प्रोटीन लाइसेट्स के पश्चिमी सोख्ता के बाद फॉस्फोप्रोटीन के उचित विश्लेषण और मात्रा का ठहराव के लिए सर्वोत्तम प्रथाएं प्रदान की जाती हैं। ये तकनीकें, विशेष रूप से औषधीय अवरोधकों और / या मूत्र आनुवंशिक मॉडल के संयोजन में, क्रैनियोफेशियल विकास के दौरान सक्रिय विभिन्न फॉस्फोप्रोटीन की गतिशीलता और भूमिकाओं में अधिक अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए उपयोग की जा सकती हैं।
Introduction
स्तनधारी क्रैनियोफेशियल विकास एक जटिल रूपात्मक प्रक्रिया है जिसके दौरान कई सेल आबादी फ्रंटोनासल कंकाल उत्पन्न करने के लिए समन्वय करती है। माउस में, यह प्रक्रिया भ्रूण दिवस (ई) 9.5 पर शुरू होती है, जिसमें फ्रंटोनासल प्रमुखता और मैक्सिलरी और मैंडिबुलर प्रक्रियाओं के जोड़े के गठन के साथ, जिनमें से प्रत्येक में पोस्ट-प्रवासी कपाल तंत्रिका शिखा कोशिकाएं होती हैं। पार्श्व और औसत दर्जे का नाक प्रक्रियाएं नाक के गड्ढों की उपस्थिति के साथ फ्रंटोनासल प्रमुखता से उत्पन्न होती हैं और अंततः नथुने बनाने के लिए फ्यूज होती हैं। इसके अलावा, औसत दर्जे का नाक प्रक्रियाओं और दाढ़ की हड्डी की प्रक्रियाएं ऊपरी होंठ उत्पन्न करने के लिए फ्यूज करती हैं। समवर्ती रूप से, पैलेटोजेनेसिस को ई 11.5 पर मैक्सिलरी प्रक्रियाओं के मौखिक पक्ष से अलग-अलग आउटग्रोथ – माध्यमिक तालु अलमारियों के गठन के साथ शुरू किया जाता है। समय के साथ, तालु अलमारियां जीभ के दोनों तरफ नीचे की ओर बढ़ती हैं, जीभ के ऊपर एक विरोधी स्थिति में बढ़ जाती हैं, और अंततः एक निरंतर तालु बनाने के लिए मिडलाइन पर फ्यूज होती हैं जो ई 16.51 द्वारा नाक और मौखिक गुहाओं को अलग करती है।
क्रैनियोफेशियल विकास में इन रूपात्मक परिवर्तनों को विविध सिग्नलिंग इंटरैक्शन के माध्यम से शुरू और निरंतर किया जाता है, जिसमें अक्सर किनेसेस द्वारा प्रोटीन फॉस्फोराइलेशन शामिल होता है। उदाहरण के लिए, कोशिका झिल्ली रिसेप्टर्स, जैसे हड्डी मॉर्फोजेनेटिक प्रोटीन रिसेप्टर्स (बीएमपीआरएस), और विभिन्न रिसेप्टर टायरोसिन किनेज (आरटीके) परिवारों सहित विकास कारक (टीजीएफ) -β रिसेप्टर्स को बदलने के उप-परिवारों, लिगैंड बाइंडिंग और कपाल तंत्रिका शिखा कोशिकाओं 2,3,4 में सक्रियण पर ऑटोफॉस्फोरिलेटेड होते हैं . इसके अतिरिक्त, जी प्रोटीन-युग्मित ट्रांसमेम्ब्रेन रिसेप्टर स्मूथेन्ड क्रैनियल न्यूरल क्रेस्ट कोशिकाओं में फॉस्फोराइलेटेड हो जाता है और सोनिक हेजहोग (एसएचएच) लिगैंड के क्रैनियोफेशियल एक्टोडर्म डाउनस्ट्रीम पैच 1 रिसेप्टर के लिए बाध्यकारी होता है, जिसके परिणामस्वरूप सिलिअरी झिल्ली और एसएचएच मार्ग सक्रियण5 पर चिकना संचय होता है। इस तरह के लिगैंड-रिसेप्टर इंटरैक्शन क्रैनियोफेशियल संदर्भों में ऑटोक्राइन, पैराक्राइन और / या जुक्स्टाक्राइन सिग्नलिंग के माध्यम से हो सकते हैं। उदाहरण के लिए, बीएमपी 6 को चोंड्रोसाइट भेदभाव6 के दौरान एक ऑटोक्राइन तरीके से संकेत देने के लिए जाना जाता है, जबकि फाइब्रोब्लास्ट ग्रोथ फैक्टर (एफजीएफ) 8 को ग्रसनी आर्क एक्टोडर्म में व्यक्त किया जाता है और आरटीके के एफजीएफ परिवार के सदस्यों को बांधता है जो ग्रसनी आर्क मेसेंकाइमल में एक पैराक्राइन फैशन में व्यक्त किया जाता है ताकि ग्रसनी मेहराब 7 के पैटर्निंग और आउटग्रोथ को शुरू कियाजा सके, 8,9,10. इसके अलावा, नॉच सिग्नलिंग को क्रैनियोफेशियल कंकाल के विकास के दौरान चोंड्रोसाइट्स और ओस्टियोब्लास्ट दोनों में जुक्स्टाक्राइन सिग्नलिंग के माध्यम से सक्रिय किया जाता है जब ट्रांसमेम्ब्रेन डेल्टा और / या दांतेदार लिगैंड पड़ोसी कोशिकाओं पर ट्रांसमेम्ब्रेन नॉच रिसेप्टर्स से बंधते हैं, जो बाद में क्लीव और फॉस्फोराइलेटेड11 होते हैं। हालांकि, क्रैनियोफेशियल विकास के लिए महत्वपूर्ण अन्य लिगैंड और रिसेप्टर जोड़े हैं जिनमें ऑटोक्राइन और पैराक्राइन सिग्नलिंग दोनों में कार्य करने के लिए लचीलापन है। एक उदाहरण के रूप में, मूत्र दांत मॉर्फोजेनेसिस के दौरान, प्लेटलेट-व्युत्पन्न विकास कारक (पीडीजीएफ) -एए लिगैंड को तामचीनी अंग उपकला12 में आरटीके पीडीजीएफआर को सक्रिय करने के लिए ऑटोक्राइन तरीके से संकेत देने के लिए प्रदर्शित किया गया है। इसके विपरीत, मध्य-गर्भावस्था के दौरान मूत्र चेहरे की प्रक्रियाओं में, लिगैंड पीडीजीएफ-एए और पीडीजीएफ-सीसी को एन्कोडिंग करने वाले टेप क्रैनियोफेशियल एक्टोडर्म में व्यक्त किए जाते हैं, जबकि पीडीजीएफआर रिसेप्टर अंतर्निहित कपाल तंत्रिका शिखा-व्युत्पन्न मेसेंकाइमल में व्यक्त किया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप पैराक्राइन सिग्नलिंग 13,14,15,16,17 होता है . सिग्नलिंग तंत्र के बावजूद, इन रिसेप्टर फॉस्फोराइलेशन घटनाओं के परिणामस्वरूप अक्सर एडाप्टर प्रोटीन और / या सिग्नलिंग अणुओं की भर्ती होती है, जो अक्सर माइटोजेन-सक्रिय प्रोटीन किनेज (एमएपीके) मार्ग18,19 जैसे इंट्रासेल्युलर किनेज कैस्केड शुरू करने के लिए खुद को फॉस्फोराइलेटेड हो जाते हैं।
इन कैस्केड के टर्मिनल इंट्रासेल्युलर प्रभावक तब सब्सट्रेट्स की एक सरणी को फॉस्फोराइलेट कर सकते हैं, जैसे ट्रांसक्रिप्शन कारक, आरएनए-बाइंडिंग, साइटोस्केलेटल और एक्स्ट्रासेल्युलर मैट्रिक्स प्रोटीन। रनएक्स 220, हैंड 121, डीएलएक्स 3/5 22,23,24, ग्लि 1-3 25, और सॉक्स 926 क्रैनियोफेशियल विकास के संदर्भ में फॉस्फोराइलेटेड ट्रांसक्रिप्शन कारकों में से हैं। यह पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधन (पीटीएम) अन्य गतिविधियों20,21,25,26 के बीच वैकल्पिक पीटीएम, डिमराइजेशन, स्थिरता, दरार, और / या डीएनए-बाध्यकारी आत्मीयता के लिए संवेदनशीलता को सीधे प्रभावित कर सकता है। इसके अतिरिक्त, आरएनए-बाध्यकारी प्रोटीन एसआरएसएफ 3 को क्रैनियोफेशियल विकास के संदर्भ में फॉस्फोराइलेट किया जाता है, जिससे इसके परमाणु स्थानान्तरण27 हो जाते हैं। सामान्य तौर पर, आरएनए-बाध्यकारी प्रोटीन के फॉस्फोराइलेशन को उनके उपकोशिकीय स्थानीयकरण, प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन, आरएनए बाध्यकारी, और / या अनुक्रम विशिष्टता28 को प्रभावित करने के लिए दिखाया गया है। इसके अलावा, एक्टोमायोसिन के फॉस्फोराइलेशन से क्रैनियोफेशियल विकास29,30 में साइटोस्केलेटल पुनर्व्यवस्था हो सकती है, और बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन का फॉस्फोराइलेशन, जैसे कि छोटे इंटीग्रिन-बाइंडिंग लिगैंड एन-लिंक्ड ग्लाइकोप्रोटीन, कंकाल के विकास के दौरान जैवखनिजीकरण में योगदान देता है31. उपर्युक्त और कई अन्य उदाहरणों के माध्यम से, यह स्पष्ट है कि क्रैनियोफेशियल विकास के दौरान प्रोटीन फॉस्फोराइलेशन के लिए व्यापक निहितार्थ हैं। विनियमन के एक अतिरिक्त स्तर को जोड़ते हुए, प्रोटीन फॉस्फोराइलेशन को फॉस्फेटेस द्वारा आगे संशोधित किया जाता है, जो फॉस्फेट समूहों को हटाकर किनेसेस का मुकाबला करता है।
रिसेप्टर और प्रभावक अणु दोनों स्तरों पर ये फॉस्फोराइलेशन घटनाएं सिग्नलिंग मार्गों के प्रसार के लिए महत्वपूर्ण हैं और अंततः नाभिक में जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन के परिणामस्वरूप, विशिष्ट सेल गतिविधियों को चलाती हैं, जैसे माइग्रेशन, प्रसार, अस्तित्व और भेदभाव, जिसके परिणामस्वरूप स्तनधारी चेहरे का उचित गठन होता है। किनेसेस और फॉस्फेटेस के साथ प्रोटीन इंटरैक्शन की संदर्भ विशिष्टता, पीटीएम में परिणामी परिवर्तन, और सेल गतिविधि पर उनके प्रभावों को देखते हुए, यह महत्वपूर्ण है कि इन मापदंडों का अध्ययन शारीरिक रूप से प्रासंगिक सेटिंग में किया जाए ताकि क्रैनियोफेशियल विकास के लिए फॉस्फोराइलेशन घटनाओं के योगदान की पूरी समझ हासिल की जा सके। यहां, प्रोटीन के फॉस्फोराइलेशन का अध्ययन करने के लिए दो संदर्भों के उदाहरण और इस प्रकार, स्तनधारी क्रैनियोफेशियल विकास के दौरान सिग्नलिंग मार्गों की सक्रियता प्रदान की जाती है: माउस चेहरे की प्रक्रियाएं, विशेष रूप से ई 11.5 मैक्सिलरी प्रक्रियाओं में, और ई 13.5 माध्यमिक तालु अलमारियों से व्युत्पन्न सुसंस्कृत माउस भ्रूण तालु मेसेंकाइम कोशिकाएं – दोनों प्राथमिक32 और अमर33 . ई 11.5 पर, दाढ़ की हड्डी की प्रक्रिया पार्श्व और औसत दर्जे की नाक प्रक्रियाओं1 के साथ फ्यूज करने की प्रक्रिया में होती है, जिससे माउस क्रैनियोफेशियल विकास के दौरान एक महत्वपूर्ण समय बिंदु का प्रतिनिधित्व होता है। इसके अलावा, तालु अलमारियों से व्युत्पन्न मैक्सिलरी प्रक्रियाओं और कोशिकाओं को यहां चुना गया था क्योंकि बाद की संरचनाएं पूर्व के डेरिवेटिव हैं, जिससे शोधकर्ताओं को संबंधित संदर्भों में विवो और इन विट्रो में प्रोटीन फॉस्फोराइलेशन से पूछताछ करने का अवसर प्रदान किया जाता है। हालांकि, यह प्रोटोकॉल वैकल्पिक चेहरे की प्रक्रियाओं और विकासात्मक समय बिंदुओं पर भी लागू होता है।
फॉस्फोरिलेटेड प्रोटीन का अध्ययन करने में एक महत्वपूर्ण समस्या यह है कि वे प्रचुर मात्रा में पर्यावरणीय फॉस्फेट द्वारा प्रोटीन अलगाव के दौरान आसानी से डिफॉस्फोरिलेटेड होते हैं। इस बाधा को दूर करने के लिए, मानक प्रयोगशाला विधियों के अनुकूलन और संशोधन जो फॉस्फोरिलेटेड प्रोटीन के अलगाव की अनुमति देते हैं, पर चर्चा की जाती है। इसके अतिरिक्त, फॉस्फोरिलेटेड प्रोटीन के उचित विश्लेषण और मात्रा का ठहराव के लिए सर्वोत्तम प्रथाएं प्रदान की जाती हैं। या मूत्र आनुवंशिक मॉडल के साथ संयोजन में, क्रैनियोफेशियल विकास के दौरान सक्रिय विभिन्न सिग्नलिंग मार्गों की गतिशीलता और भूमिकाओं में अधिक अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां वर्णित प्रोटोकॉल शोधकर्ताओं को एक मजबूत और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य तरीके से क्रैनियोफेशियल विकास के दौरान महत्वपूर्ण फॉस्फोराइलेशन-निर्भर सिग्नलिंग घटनाओं की जांच करने की अनुमति देता ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
फिलिप सोरियानो, माउंट सिनाई में इकान स्कूल ऑफ मेडिसिन से एक उपहार थे। इस काम को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ (एनआईएच)/नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ डेंटल एंड क्रैनियोफेशियल रिसर्च (एनआईडीसीआर) आर01 डीई027689 और के02 डीई028572 से केएएफ, एफ31 डीई029976 से एमएआर और एफ31 डीई029364 से बीजेसीडी तक के फंड से धन के साथ समर्थित किया गया था।
Materials
| Equipment | |||
| Block for mini dry bath | Research Products International Corp | 400783 | |
| ChemiDoc XRS+ imaging system with Image Lab software | Bio-Rad | 1708265 | chemiluminescence imager |
| CO2 incubator, air jacket | VWR | 10810-902 | |
| Dissecting board, 11 x 13 in | Fisher Scientific | 09 002 12 | |
| Electrophoresis cell, 4-gel, for mini precast gels with mini trans-blot module | Bio-Rad | 1658030 | |
| Hybridization oven | Fisher Scientific | UVP95003001 | |
| Microcentrifuge 5415 D with F45-24-11 rotor (Eppendorf) | Sigma Aldrich | Z604062 | |
| Mini dry bath | Research Products International Corp | 400780 | |
| Orbital shaker | VWR | 89032-092 | |
| pH meter | VWR | 89231-662 | |
| Power supply for SDS-PAGE | Bio-Rad | 1645050 | |
| Rectangular ice pan, maxi 9 L | Fisher Scientific | 07-210-093 | |
| Stemi 508 stereo microscope with stand K LAB, LED ring light | Zeiss | 4350649020000000 | dissecting microscope |
| Timer | VWR | 62344-641 | |
| Tube revolver | Fisher Scientific | 11 676 341 | |
| Vortex mixer | Fisher Scientific | 02 215 414 | |
| Water bath | VWR | 89501-472 | |
| Western blot box | Fisher Scientific | NC9358182 | |
| Materials | |||
| Cell culture dishes, 6 cm | Fisher Scientific | 12-565-95 | |
| Cell culture plates, 12 well | Fisher Scientific | 07-200-82 | |
| Cell lifters | Fisher Scientific | 08-100-240 | |
| CO2 | Airgas | CD USP50 | |
| Conical tubes, polypropylene, 50 mL | Fisher Scientific | 05-539-13 | |
| Dumont #5 fine forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Embryo spoon | Fine Science Tools | 10370-17 | |
| Microcentrifuge tubes, 0.5 mL | VWR | 89000-010 | |
| Microcentrifuge tubes, 1.5 mL | VWR | 20170-038 | |
| Pasteur pipet, 5.75" | Fisher Scientific | 13-678-6A | |
| Pasteur pipet, 9" | VWR | 14672-380 | |
| Petri dishes, 10 cm | Fisher Scientific | 08-757-100D | |
| Petri dishes, 35 mm | Fisher Scientific | FB0875711YZ | |
| Pouches, transparent, polyethylene lining | Fisher Scientific | 01-812-25B | |
| PVDF membrane | Fisher Scientific | IPVH00010 | |
| Semken forceps | Fine Science Tools | 11008-13 | |
| Small latex bulb, 2 mL | VWR | 82024-554 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 14002-12 | |
| Syringe filter, 25 mm, 0.2 μm pore size | Fisher Scientific | 09-740-108 | |
| Syringe with luer tip, 10 mL | VWR | BD309604 | |
| Transfer pipet | Fisher Scientific | 13-711-22 | |
| Western blot cassette opening lever | Bio-Rad | 4560000 | |
| Whatmann 3MM chr chromatography paper | Fisher Scientific | 05-714-5 | |
| Reagents | |||
| 4-15% Precast protein gels, 10-well, 30 µL | Bio-Rad | 4561083 | |
| β-glycerophosphate disodium salt hydrate | Sigma Aldrich | G5422-25G | stock concentration 1 M |
| β-mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M3148-100ML | |
| Bovine serum albumin, fraction V, heat shock tested | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| Bromophenol blue | Fisher Scientific | AC403140050 | |
| Complete mini protease inhibitor cocktail | Sigma Aldrich | 11836153001 | stock concentration 25x |
| DC protein assay kit II | Bio-Rad | 500-0112 | |
| DMEM, high glucose | Gibco | 11965092 | |
| E7, mouse monoclonal beta tubulin primary antibody, concentrate 0.1 mL | Developmental Studies Hybridoma Bank | E7 | 1:1,000 |
| ECL western blotting substrate | Fisher Scientific | PI32106 | low picogram range |
| ECL western blotting substrate | Genesee Scientific | 20-302B | low femtogram range |
| Electrophoresis buffer, 5 L | Bio-Rad | 1610772 | stock concentration 10x |
| Ethanol, 200 proof, 1 gallon | Decon Laboratories, Inc. | 2705HC | EtOH |
| Ethylenediaminetetraacetic acid, Di Na salt dihydr. (crystalline powd./electrophor.) | Fisher Scientific | BP120-500 | EDTA |
| Fetal bovine serum, characterized, US origin, 500 mL | HyClone | SH30071.03 | |
| Glycerol (certified ACS) | Fisher Scientific | G33-4 | |
| HRP-conjugated secondary antibody, goat anti-mouse IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 115-035-146 | 1:20,000 |
| HRP-conjugated secondary antibody, goat anti-rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 111-035-003 | 1:20,000 |
| Hydrochloric acid solution, 6N (certified) | Fisher Scientific | SA56-500 | HCl |
| Igepal Ca – 630 non-ionic detergent | Fisher Scientific | ICN19859650 | Nonidet P-40 |
| Isopropanol (HPLC) | Fisher Scientific | A451-1 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030081 | stock concentration 200 mM |
| Methanol | Fisher Scientific | A454-4 | |
| p44/42 MAPK (Erk1/2) primary antibody | Cell Signaling Technology | 9102S | 1:1,000; anti-Erk1/2 |
| PDGF-BB recombinant ligand, rat | Fisher Scientific | 520BB050 | |
| PDGF Receptor β primary antibody | Cell Signaling Technology | 3169S | 1:1,000 |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | stock concentration 100 U/mL, 100 µg/mL |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride, 99% | Fisher Scientific | AC215740100 | PMSF; stock concentration 100 mM |
| Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) primary antibody | Cell Signaling Technology | 9101S | 1:1,000, anti-phospho-Erk1/2 |
| Phospho-PDGF Receptor α /PDGF Receptor β primary antibody | Cell Signaling Technology | 3170S | 1:1,000 |
| Potassium chloride (white crystals) | Fisher Scientific | BP366-500 | KCl |
| Potassium phosphate monobasic (white crystals) | Fisher Scientific | BP362-500 | KH2PO4 |
| SDS solution, 10% | Bio-Rad | 161-0416 | |
| Sodium chloride (crystalline/biological,certified) | Fisher Scientific | S671-3 | NaCl |
| Sodium fluoride (powder/certified ACS) | Fisher Scientific | S299-100 | NaF; aliquot for one time use; stock concentration 1 M |
| Sodium orthovanadate, 99% | Fisher Scientific | AC205330500 | Na3VO4; stock concentration 100 mM |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous (granular or powder/certified ACS) | Fisher Scientific | S374-500 | Na2HPO4 |
| Tissue culture PBS | Fisher Scientific | 21-031-CV | |
| Transfer buffer, 5 L | Bio-Rad | 1610771 | stock concentration 10x |
| Tris base (white crystals or crystalline powder/molecular biology) | Fisher Scientific | BP152-1 | |
| Trypsin | BioWorld | 21560033 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Western blot molecular weight marker | Bio-Rad | 1610374 | |
| Software | |||
| ImageJ software | National Institutes of Health | ||
| Animals | |||
| Female 129S4 mice | gift of Dr. Philippe Soriano, Icahn School of Medicine at Mount Sinai |
References
- Bush, J. O., Jiang, R. Palatogenesis: morphogenetic and molecular mechanisms of secondary palate development. Development. 139 (2), 231-243 (2012).
- Chai, Y., Ito, Y., Han, J. TGF-beta signaling and its functional significance in regulating the fate of cranial neural crest cells. Critical Reviews in Oral Biology & Medicine. 14 (2), 78-88 (2003).
- Nie, X., Luukko, K., Kettunen, P. BMP signalling in craniofacial development. TheInternational Journal of Developmental Biology. 50 (6), 511-521 (2006).
- Fantauzzo, K. A., Soriano, P. Receptor tyrosine kinase signaling: regulating neural crest development one phosphate at a time. Current Topics in Developmental Biology. 111, 135-182 (2015).
- Xavier, G. M., et al. Hedgehog receptor function during craniofacial development. 발생학. 415 (2), 198-215 (2016).
- Grimsrud, C. D., et al. BMP-6 is an autocrine stimulator of chondrocyte differentiation. Journal of Bone and Mineral Research. 14 (4), 475-482 (1999).
- MacArthur, C. A., et al. FGF-8 isoforms activate receptor splice forms that are expressed in mesenchymal regions of mouse development. Development. 121 (11), 3603-3613 (1995).
- Tucker, A. S., Yamada, G., Grigoriou, M., Pachnis, V., Sharpe, P. T. Fgf-8 determines rostral-caudal polarity in the first branchial arch. Development. 126 (1), 51-61 (1999).
- Trumpp, A., Depew, M. J., Rubenstein, J. L., Bishop, J. M., Martin, G. R. Cre-mediated gene inactivation demonstrates that FGF8 is required for cell survival and patterning of the first branchial arch. Genes & Development. 13 (23), 3136-3148 (1999).
- Tabler, J. M., et al. Fuz mutant mice reveal shared mechanisms between ciliopathies and FGF-related syndromes. Developmental Cell. 25 (6), 623-635 (2013).
- Pakvasa, M., et al. Notch signaling: Its essential roles in bone and craniofacial development. Genes & Diseases. 8 (1), 8-24 (2021).
- Chai, Y., Bringas, P., Mogharei, A., Shuler, C. F., Slavkin, H. C. PDGF-A and PDGFR-alpha regulate tooth formation via autocrine mechanism during mandibular morphogenesis in vitro. Developmental Dynamics. 213 (4), 500-511 (1998).
- Morrison-Graham, K., Schatteman, G. C., Bork, T., Bowen-Pope, D. F., Weston, J. A. A PDGF receptor mutation in the mouse (Patch) perturbs the development of a non-neuronal subset of neural crest-derived cells. Development. 115 (1), 133-142 (1992).
- Orr-Urtreger, A., Lonai, P. Platelet-derived growth factor-A and its receptor are expressed in separate, but adjacent cell layers of the mouse embryo. Development. 115 (4), 1045-1058 (1992).
- Ding, H., et al. The mouse Pdgfc gene: dynamic expression in embryonic tissues during organogenesis. Mechanisms of Development. 96 (2), 209-213 (2000).
- Hamilton, T. G., Klinghoffer, R. A., Corrin, P. D., Soriano, P. Evolutionary divergence of platelet-derived growth factor alpha receptor signaling mechanisms. Molecular and Cellular Biology. 23 (11), 4013-4025 (2003).
- He, F., Soriano, P. A critical role for PDGFRalpha signaling in medial nasal process development. PLoS Genetics. 9 (9), 1003851 (2013).
- Schlessinger, J. Cell signaling by receptor tyrosine kinases. Cell. 103 (2), 211-225 (2000).
- Lemmon, M. A., Schlessinger, J. Cell signaling by receptor tyrosine kinases. Cell. 141 (7), 1117-1134 (2010).
- Kim, W. J., Shin, H. L., Kim, B. S., Kim, H. J., Ryoo, H. M. RUNX2-modifying enzymes: therapeutic targets for bone diseases. Experimental & Molecular Medicine. 52 (8), 1178-1184 (2020).
- Firulli, B. A., Firulli, A. B. Partially penetrant cardiac neural crest defects in Hand1 Phosphomutant mice: Dimer choice that is not so critical. Pediatric Cardiology. 40 (7), 1339-1344 (2019).
- Choi, Y. H., Choi, H. J., Lee, K. Y., Oh, J. W. Akt1 regulates phosphorylation and osteogenic activity of Dlx3. Biochemical and Biophysical Research Communications. 425 (4), 800-805 (2012).
- Jeong, H. M., et al. Akt phosphorylates and regulates the function of Dlx5. Biochemical and Biophysical Research Communications. 409 (4), 681-686 (2011).
- Seo, J. H., et al. Calmodulin-dependent kinase II regulates Dlx5 during osteoblast differentiation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 384 (1), 100-104 (2009).
- Gou, Y., Zhang, T., Xu, J. Transcription factors in craniofacial development: From receptor signaling to transcriptional and epigenetic regulation. Current Topics in Developmental Biology. 115, 377-410 (2015).
- Schock, E. N., LaBonne, C. Sorting sox: Diverse roles for sox transcription factors during neural crest and craniofacial development. Frontiers in Physiology. 11, 606889 (2020).
- Dennison, B. J. C., Larson, E. D., Fu, R., Mo, J., Fantauzzo, K. A. Srsf3 mediates alternative RNA splicing downstream of PDGFRalpha signaling in the facial mesenchyme. Development. 148 (14), (2021).
- Stamm, S. Regulation of alternative splicing by reversible protein phosphorylation. Journal of Biological Chemistry. 283 (3), 1223-1227 (2008).
- Szabo, A., Mayor, R. Mechanisms of neural crest migration. Annual Review of Genetics. 52, 43-63 (2018).
- Kindberg, A. A., Bush, J. O. Cellular organization and boundary formation in craniofacial development. Genesis. 57 (1), 23271 (2019).
- Faundes, V., et al. Raine syndrome: an overview. European Journal of Medical Genetics. 57 (9), 536-542 (2014).
- Bush, J. O., Soriano, P. Ephrin-B1 forward signaling regulates craniofacial morphogenesis by controlling cell proliferation across Eph-ephrin boundaries. Genes & Development. 24 (18), 2068-2080 (2010).
- Fantauzzo, K. A., Soriano, P. Generation of an immortalized mouse embryonic palatal mesenchyme cell line. PLoS One. 12 (6), 0179078 (2017).
- Goering, J. P., Isai, D. G., Czirok, A., Saadi, I. Isolation and time-lapse imaging of primary mouse embryonic palatal mesenchyme cells to analyze collective movement attributes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (168), e62151 (2021).
- JoVE. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. Science Education Database. , (2022).
- . Analyzing gels and western blots with ImageJ Available from: https://lukemiller.og/index.php/2010/11/analyzing-gels-and-western-blots-with-images-j/ (2010)
- Fantauzzo, K. A., Soriano, P. PI3K-mediated PDGFRalpha signaling regulates survival and proliferation in skeletal development through p53-dependent intracellular pathways. Genes & Development. 28 (9), 1005-1017 (2014).
- Wang, Y., et al. Rapid alteration of protein phosphorylation during postmortem: implication in the study of protein phosphorylation. Scientific Reports. 5, 15709 (2015).
- Sharma, S. K., Carew, T. J. Inclusion of phosphatase inhibitors during Western blotting enhances signal detection with phospho-specific antibodies. Analytical Biochemistry. 307 (1), 187-189 (2002).
- Bass, J. J., et al. An overview of technical considerations for Western blotting applications to physiological research. Scandinavian Journal of Medicine & Science in Sports. 27 (1), 4-25 (2017).
- Hooper, J. E., et al. Systems biology of facial development: contributions of ectoderm and mesenchyme. 발생학. 426 (1), 97-114 (2017).
- Childs, C. B., Proper, J. A., Tucker, R. F., Moses, H. L. Serum contains a platelet-derived transforming growth factor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (17), 5312-5316 (1982).
- Swaisgood, H. E. Review and update of casein chemistry. Journal of Dairy Science. 76 (10), 3054-3061 (1993).
- Silva, J. M., McMahon, M. The fastest Western in town: a contemporary twist on the classic Western blot analysis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (84), e51149 (2014).
- Salinovich, O., Montelaro, R. C. Reversible staining and peptide mapping of proteins transferred to nitrocellulose after separation by sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis. Analytical Biochemistry. 156 (2), 341-347 (1986).
