JoVE Journal > Developmental Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
자동 번역
발생학

Isolering av hele celleprotein lysater fra mus ansiktsprosesser og kultivert palatal mesenchyme celler for fosfoprotein analyse

Published: April 01, 2022
doi:
10.3791/63834
, ,
1Department of Craniofacial Biology, School of Dental Medicine,University of Colorado Anschutz Medical Campus

Summary

Protokollen presenterer en metode for å isolere hele celleprotein lysater fra dissekerte museembryo ansiktsprosesser eller dyrket mus embryonale palatal mesenchyme celler og utføre påfølgende vestlig blotting for å vurdere fosforylatert protein nivåer.

Abstract

Pattedyr kraniofacial utvikling er en kompleks morfologisk prosess der flere cellepopulasjoner koordinerer for å generere frontonasal skjelettet. Disse morfologiske endringene initieres og opprettholdes gjennom ulike signalinteraksjoner, som ofte inkluderer proteinfosforylering av kinaser. Her gis to eksempler på fysiologisk relevante sammenhenger for å studere fosforylering av proteiner under pattedyr kraniofacial utvikling: muse ansiktsbehandlingsprosesser, spesielt E11,5 maksillære prosesser, og kultivert mus embryonale palatalmesenchyme celler avledet fra E13,5 sekundære palatalhyller. For å overvinne den vanlige barrieren for defosforylering under proteinisolasjon, diskuteres tilpasninger og modifikasjoner til standard laboratoriemetoder som muliggjør isolering av fosfoproteiner. I tillegg er beste praksis gitt for riktig analyse og kvantifisering av fosfoproteiner etter vestlig blotting av hele celleproteinlysater. Disse teknikkene, spesielt i kombinasjon med farmakologiske hemmere og/eller muringenetiske modeller, kan brukes til å få større innsikt i dynamikken og rollene til ulike fosfoproteiner som er aktive under kraniofacial utvikling.

Introduction

Pattedyr kraniofacial utvikling er en kompleks morfologisk prosess der flere cellepopulasjoner koordinerer for å generere frontonasal skjelettet. I musen begynner denne prosessen på embryonal dag (E) 9,5 med dannelsen av frontonasal prominens og par av maksillære og mandibulære prosesser, som hver inneholder postmigrerende kraniale nevrale kamceller. De laterale og mediale neseprosessene oppstår fra frontonasal prominens med utseendet på nesegravene og til slutt smelter sammen for å danne neseborene. Videre smelter mediale neseprosesser og maksillære prosesser sammen for å generere overleppen. Samtidig initieres palatogenesis med dannelsen av forskjellige utvekster – de sekundære palatalhyllene – fra den muntlige siden av maksillære prosesser på E11,5. Over tid vokser palasshyllene nedover på hver side av tungen, løfter seg til en motsatt posisjon over tungen, og til slutt smelter de sammen ved midtlinjen for å danne en kontinuerlig gane som skiller nese- og munnhulene med E16,51.

Disse morfologiske endringene gjennom kraniofacial utvikling er initiert og opprettholdt gjennom ulike signalinteraksjoner, som ofte inkluderer proteinfosforylering av kinases. For eksempel er cellemembranreseptorer, som underfamilier av transformerende vekstfaktor (TGF)-β reseptorer, inkludert benmorfogenetiske proteinreseptorer (BMPRs) og ulike reseptor tyrosinkinasefamilier (RTK), autofosforylert ved ligandbinding og aktivering i kranial nevrale kamceller 2,3,4 . I tillegg blir G protein-koblet transmembranreseptor Smoothened fosforylert i kranial nevrale kamceller og kraniofacial ektoderm nedstrøms for Sonic pinnsvin (SHH) ligandbinding til Patched1-reseptoren, noe som resulterer i glattet akkumulering ved ciliary membranen og SHH-baneaktivering5. Slike ligandreseptorinteraksjoner kan forekomme gjennom autokriminelle, parakrine- og/eller jukstakrinsignalering i kraniofaciale sammenhenger. For eksempel er BMP6 kjent for å signalisere på en autocrine måte under kondrocyttdifferensiering6, mens fibroblast vekstfaktor (FGF) 8 uttrykkes i pharyngeal arch ectoderm og binder seg til medlemmer av FGF-familien av RTK uttrykt i pharyngeal arch mesenchyme på en paracrine måte for å initiere mønster og utvekst av pharyngeal buer7, 8,9,10. Videre aktiveres Notch-signalering i både kondrocytter og osteoblaster under kraniofacial skjelettutvikling gjennom jukstakrinsignalering når transmembrane Delta og/eller Taggete ligander binder seg til transmembrane Notch-reseptorer på nærliggende celler, som senere spaltes og fosforyllatert11. Imidlertid er det andre ligand- og reseptorpar som er viktige for kraniofacial utvikling som har fleksibilitet til å fungere i både autocrine og paracrine signalering. Som et eksempel, under murin tannmorfogenese, har blodplate-avledet vekstfaktor (PDGF)-AA ligand vist seg å signalisere på en autocrine måte å aktivere RTK PDGFRα i emaljeorganet epitel12. I murine ansiktsbehandlingsprosesser under midten av svangerskapet uttrykkes transkripsjoner som koder ligandene PDGF-AA og PDGF-CC i kraniofacial etoderm, mens PDGFRα-reseptoren uttrykkes i den underliggende kranial nevrale kam-avledede mesenchymen, noe som resulterer iparakrinesignalering 13,14,15,16,17 . Uavhengig av signalmekanismen resulterer disse reseptorfosforyleringshendelsene ofte i rekruttering av adapterproteiner og / eller signalmolekyler, som ofte blir fosforylert selv for å initiere intracellulære kinasekaskader som mitogenaktivert proteinkinase (MAPK) sti18,19.

Terminalens intracellulære effektorer av disse kaskadene kan deretter fosforylere en rekke substrater, for eksempel transkripsjonsfaktorer, RNA-bindende, cytoskeletale og ekstracellulære matriseproteiner. Runx220, Hand121, Dlx3/5 22,23,24, Gli1-3 25 og Sox926 er blant transkripsjonsfaktorene fosforylert i sammenheng med kraniofacial utvikling. Denne postoversettelsesendringen (PTM) kan direkte påvirke følsomheten for alternative PTMer, dimerisering, stabilitet, spalting og/eller DNA-bindende affinitet, blant annetaktiviteter på 20,21,25,26. I tillegg er det RNA-bindende proteinet Srsf3 fosforylert i sammenheng med kraniofacial utvikling, noe som fører til kjernefysisk translokasjon27. Generelt har fosforylering av RNA-bindende proteiner vist seg å påvirke deres subcellulære lokalisering, proteinproteininteraksjoner, RNA-binding og / eller sekvensspesifikkitet28. Videre kan fosforylering av actomyosin føre til cytoskeletale omorganiseringer gjennom kraniofacial utvikling29,30, og fosforylering av ekstracellulære matriseproteiner, som små integrinbindende ligand N-koblede glykoproteiner, bidrar til biomineralisering under skjelettutvikling31. Gjennom ovennevnte og mange andre eksempler er det tydelig at det er store implikasjoner for proteinfosforylering under kraniofacial utvikling. Ved å legge til et ekstra reguleringsnivå, moduleres proteinfosforylering ytterligere av fosfater, som motvirker kinaser ved å fjerne fosfatgrupper.

Disse fosforyleringshendelsene på både reseptor- og effektormolekylnivåene er avgjørende for forplantning av signalveier og resulterer til slutt i endringer i genuttrykk i kjernen, som driver spesifikke celleaktiviteter, for eksempel migrasjon, spredning, overlevelse og differensiering, noe som resulterer i riktig dannelse av pattedyrets ansikt. Gitt kontekstspesifisiteten av proteininteraksjoner med kinaser og fosfater, de resulterende endringene i PTMer, og deres effekter på celleaktivitet, er det avgjørende at disse parametrene studeres i en fysiologisk relevant setting for å få full forståelse av bidraget av fosforyleringshendelser til kraniofacial utvikling. Her gis eksempler på to sammenhenger for å studere fosforylering av proteiner og dermed aktivering av signalveier under pattedyr kraniofacial utvikling: muse ansiktsbehandlingsprosesser, spesielt E11.5 maksillære prosesser, og kultivert mus embryonale palatalmesenchymeceller avledet fra E13.5 sekundære palatalhyller – både primær32 og udødeliggjort33. . På E11.5 er de maksillære prosessene i ferd med å fusjonere med laterale og mediale neseprosesser1, og representerer dermed et kritisk tidspunkt under musekraniofacial utvikling. Videre ble maksillære prosesser og celler avledet fra palatalhyllene valgt her fordi de sistnevnte strukturene er derivater av førstnevnte, og dermed gir forskerne muligheten til å forhøre proteinfosforylering in vivo og in vitro i relaterte sammenhenger. Denne protokollen gjelder imidlertid også for alternative ansiktsprosesser og utviklingstidspunkter.

Et kritisk problem med å studere fosforylaterte proteiner er at de lett defosforeres under proteinisolasjon ved rikelig miljøfosfatase. For å overvinne denne barrieren diskuteres tilpasninger og modifikasjoner til standard laboratoriemetoder som muliggjør isolering av fosforylaterte proteiner. I tillegg er beste praksis gitt for riktig analyse og kvantifisering av fosforylaterte proteiner. Disse teknikkene, spesielt i kombinasjon med farmakologiske hemmere og/eller murine genetiske modeller, kan brukes til å få større innsikt i dynamikken og rollene til ulike signalveier som er aktive under kraniofacial utvikling.

Protocol

Alle prosedyrene som involverte dyr ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved University of Colorado Anschutz Medical Campus og utført i samsvar med institusjonelle retningslinjer og forskrifter. Kvinnelige 129S4 mus ved 1,5-6 måneders alder og plassert ved en subterminutral temperatur på 21-23 °C ble brukt til embryohøsting. En skjematisk arbeidsflyt for protokollen er representert i figur 1. Se materialtabellen for detaljer om alt materia…

Representative Results

Når du prøver å karakterisere fosforylering av proteiner isolert fra muse ansiktsbehandlingsprosesser og / eller kultivert palatal mesenchyme celler, vil de representative resultatene ideelt sett avsløre et tydelig, reproduserbart bånd etter vestlig blotting med et anti-fosfoprotein antistoff som går på eller nær høyden på det tilsvarende totale proteinbåndet (figur 3 ). Men hvis omfattende fosforylering av proteinet oppstår, kan det være et lite oppadgående skifte av fosfoprot…

Discussion

Protokollen beskrevet her gjør det mulig for forskere å granske kritiske fosforyleringsavhengige signalhendelser under kraniofacial utvikling på en robust og reproduserbar måte. Det er flere kritiske trinn i denne protokollen som sikrer riktig innsamling av data og analyse av resultater. Enten du isolerer fosfoproteiner fra muse ansiktsprosesser og / eller dyrket palatal mesenchyme celler, er det viktig å bevege seg raskt og effektivt mens du holder alle reagenser og materialer på is når det er angitt. Den lave te…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

129S4 mus var en gave fra Dr. Philippe Soriano, Icahn School of Medicine ved Mount Sinai. Dette arbeidet ble støttet med midler fra National Institutes of Health (NIH)/National Institute of Dental and Craniofacial Research (NIDCR) R01 DE027689 og K02 DE028572 til K.A.F., F31 DE029976 til M.A.R. og F31 DE029364 til B.J.C.D.

Materials

Equipment
Block for mini dry bath Research Products International Corp 400783
ChemiDoc XRS+ imaging system with Image Lab software Bio-Rad 1708265 chemiluminescence imager
CO2 incubator, air jacket VWR 10810-902
Dissecting board, 11 x 13 in Fisher Scientific 09 002 12
Electrophoresis cell, 4-gel, for mini precast gels with mini trans-blot module Bio-Rad 1658030
Hybridization oven Fisher Scientific UVP95003001
Microcentrifuge 5415 D with F45-24-11 rotor (Eppendorf) Sigma Aldrich Z604062
Mini dry bath Research Products International Corp 400780
Orbital shaker VWR 89032-092
pH meter VWR 89231-662
Power supply for SDS-PAGE Bio-Rad 1645050
Rectangular ice pan, maxi 9 L Fisher Scientific 07-210-093
Stemi 508 stereo microscope with stand K LAB, LED ring light Zeiss 4350649020000000 dissecting microscope
Timer VWR 62344-641
Tube revolver Fisher Scientific 11 676 341
Vortex mixer Fisher Scientific 02 215 414
Water bath VWR 89501-472
Western blot box Fisher Scientific NC9358182
Materials
Cell culture dishes, 6 cm Fisher Scientific 12-565-95
Cell culture plates, 12 well Fisher Scientific 07-200-82
Cell lifters Fisher Scientific 08-100-240
CO2 Airgas CD USP50
Conical tubes, polypropylene, 50 mL Fisher Scientific 05-539-13
Dumont #5 fine forceps Fine Science Tools 11254-20
Embryo spoon Fine Science Tools 10370-17
Microcentrifuge tubes, 0.5 mL VWR 89000-010
Microcentrifuge tubes, 1.5 mL VWR 20170-038
Pasteur pipet, 5.75" Fisher Scientific 13-678-6A
Pasteur pipet, 9" VWR 14672-380
Petri dishes, 10 cm Fisher Scientific 08-757-100D
Petri dishes, 35 mm Fisher Scientific FB0875711YZ
Pouches, transparent, polyethylene lining Fisher Scientific 01-812-25B
PVDF membrane Fisher Scientific IPVH00010
Semken forceps Fine Science Tools 11008-13
Small latex bulb, 2 mL VWR 82024-554
Surgical scissors Fine Science Tools 14002-12
Syringe filter, 25 mm, 0.2 μm pore size Fisher Scientific 09-740-108
Syringe with luer tip, 10 mL VWR BD309604
Transfer pipet Fisher Scientific 13-711-22
Western blot cassette opening lever Bio-Rad 4560000
Whatmann 3MM chr chromatography paper Fisher Scientific 05-714-5
Reagents
4-15% Precast protein gels, 10-well, 30 µL Bio-Rad 4561083
β-glycerophosphate disodium salt hydrate Sigma Aldrich G5422-25G stock concentration 1 M
β-mercaptoethanol Sigma Aldrich M3148-100ML
Bovine serum albumin, fraction V, heat shock tested Fisher Scientific BP1600-100
Bromophenol blue Fisher Scientific AC403140050
Complete mini protease inhibitor cocktail Sigma Aldrich 11836153001 stock concentration 25x
DC protein assay kit II Bio-Rad 500-0112
DMEM, high glucose Gibco 11965092
E7, mouse monoclonal beta tubulin primary antibody, concentrate 0.1 mL Developmental Studies Hybridoma Bank E7 1:1,000
ECL western blotting substrate Fisher Scientific PI32106 low picogram range
ECL western blotting substrate Genesee Scientific 20-302B low femtogram range
Electrophoresis buffer, 5 L Bio-Rad 1610772 stock concentration 10x
Ethanol, 200 proof, 1 gallon Decon Laboratories, Inc. 2705HC EtOH
Ethylenediaminetetraacetic acid, Di Na salt dihydr. (crystalline powd./electrophor.) Fisher Scientific BP120-500 EDTA
Fetal bovine serum, characterized, US origin, 500 mL HyClone SH30071.03
Glycerol (certified ACS) Fisher Scientific G33-4
HRP-conjugated secondary antibody, goat anti-mouse IgG Jackson ImmunoResearch Laboratories 115-035-146 1:20,000
HRP-conjugated secondary antibody, goat anti-rabbit IgG Jackson ImmunoResearch Laboratories 111-035-003 1:20,000
Hydrochloric acid solution, 6N (certified) Fisher Scientific SA56-500 HCl
Igepal Ca – 630 non-ionic detergent Fisher Scientific ICN19859650 Nonidet P-40
Isopropanol (HPLC) Fisher Scientific A451-1
L-glutamine Gibco 25030081 stock concentration 200 mM
Methanol Fisher Scientific A454-4
p44/42 MAPK (Erk1/2) primary antibody Cell Signaling Technology 9102S 1:1,000; anti-Erk1/2
PDGF-BB recombinant ligand, rat Fisher Scientific 520BB050
PDGF Receptor β primary antibody Cell Signaling Technology 3169S 1:1,000
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122 stock concentration 100 U/mL, 100 µg/mL
Phenylmethanesulfonyl fluoride, 99% Fisher Scientific AC215740100 PMSF; stock concentration 100 mM
Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) primary antibody Cell Signaling Technology 9101S 1:1,000, anti-phospho-Erk1/2
Phospho-PDGF Receptor α /PDGF Receptor β primary antibody Cell Signaling Technology 3170S 1:1,000
Potassium chloride (white crystals) Fisher Scientific BP366-500 KCl
Potassium phosphate monobasic (white crystals) Fisher Scientific BP362-500 KH2PO4
SDS solution, 10% Bio-Rad 161-0416
Sodium chloride (crystalline/biological,certified) Fisher Scientific S671-3 NaCl
Sodium fluoride (powder/certified ACS) Fisher Scientific S299-100 NaF; aliquot for one time use; stock concentration 1 M
Sodium orthovanadate, 99% Fisher Scientific AC205330500 Na3VO4; stock concentration 100 mM
Sodium phosphate dibasic anhydrous (granular or powder/certified ACS) Fisher Scientific S374-500 Na2HPO4
Tissue culture PBS Fisher Scientific 21-031-CV
Transfer buffer, 5 L Bio-Rad 1610771 stock concentration 10x
Tris base (white crystals or crystalline powder/molecular biology) Fisher Scientific BP152-1
Trypsin BioWorld 21560033
Tween 20 Fisher Scientific BP337-500
Western blot molecular weight marker Bio-Rad 1610374
Software
ImageJ software National Institutes of Health
Animals
Female 129S4 mice gift of Dr. Philippe Soriano, Icahn School of Medicine at Mount Sinai
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bush, J. O., Jiang, R. Palatogenesis: morphogenetic and molecular mechanisms of secondary palate development. Development. 139 (2), 231-243 (2012).
  2. Chai, Y., Ito, Y., Han, J. TGF-beta signaling and its functional significance in regulating the fate of cranial neural crest cells. Critical Reviews in Oral Biology & Medicine. 14 (2), 78-88 (2003).
  3. Nie, X., Luukko, K., Kettunen, P. BMP signalling in craniofacial development. TheInternational Journal of Developmental Biology. 50 (6), 511-521 (2006).
  4. Fantauzzo, K. A., Soriano, P. Receptor tyrosine kinase signaling: regulating neural crest development one phosphate at a time. Current Topics in Developmental Biology. 111, 135-182 (2015).
  5. Xavier, G. M., et al. Hedgehog receptor function during craniofacial development. 발생학. 415 (2), 198-215 (2016).
  6. Grimsrud, C. D., et al. BMP-6 is an autocrine stimulator of chondrocyte differentiation. Journal of Bone and Mineral Research. 14 (4), 475-482 (1999).
  7. MacArthur, C. A., et al. FGF-8 isoforms activate receptor splice forms that are expressed in mesenchymal regions of mouse development. Development. 121 (11), 3603-3613 (1995).
  8. Tucker, A. S., Yamada, G., Grigoriou, M., Pachnis, V., Sharpe, P. T. Fgf-8 determines rostral-caudal polarity in the first branchial arch. Development. 126 (1), 51-61 (1999).
  9. Trumpp, A., Depew, M. J., Rubenstein, J. L., Bishop, J. M., Martin, G. R. Cre-mediated gene inactivation demonstrates that FGF8 is required for cell survival and patterning of the first branchial arch. Genes & Development. 13 (23), 3136-3148 (1999).
  10. Tabler, J. M., et al. Fuz mutant mice reveal shared mechanisms between ciliopathies and FGF-related syndromes. Developmental Cell. 25 (6), 623-635 (2013).
  11. Pakvasa, M., et al. Notch signaling: Its essential roles in bone and craniofacial development. Genes & Diseases. 8 (1), 8-24 (2021).
  12. Chai, Y., Bringas, P., Mogharei, A., Shuler, C. F., Slavkin, H. C. PDGF-A and PDGFR-alpha regulate tooth formation via autocrine mechanism during mandibular morphogenesis in vitro. Developmental Dynamics. 213 (4), 500-511 (1998).
  13. Morrison-Graham, K., Schatteman, G. C., Bork, T., Bowen-Pope, D. F., Weston, J. A. A PDGF receptor mutation in the mouse (Patch) perturbs the development of a non-neuronal subset of neural crest-derived cells. Development. 115 (1), 133-142 (1992).
  14. Orr-Urtreger, A., Lonai, P. Platelet-derived growth factor-A and its receptor are expressed in separate, but adjacent cell layers of the mouse embryo. Development. 115 (4), 1045-1058 (1992).
  15. Ding, H., et al. The mouse Pdgfc gene: dynamic expression in embryonic tissues during organogenesis. Mechanisms of Development. 96 (2), 209-213 (2000).
  16. Hamilton, T. G., Klinghoffer, R. A., Corrin, P. D., Soriano, P. Evolutionary divergence of platelet-derived growth factor alpha receptor signaling mechanisms. Molecular and Cellular Biology. 23 (11), 4013-4025 (2003).
  17. He, F., Soriano, P. A critical role for PDGFRalpha signaling in medial nasal process development. PLoS Genetics. 9 (9), 1003851 (2013).
  18. Schlessinger, J. Cell signaling by receptor tyrosine kinases. Cell. 103 (2), 211-225 (2000).
  19. Lemmon, M. A., Schlessinger, J. Cell signaling by receptor tyrosine kinases. Cell. 141 (7), 1117-1134 (2010).
  20. Kim, W. J., Shin, H. L., Kim, B. S., Kim, H. J., Ryoo, H. M. RUNX2-modifying enzymes: therapeutic targets for bone diseases. Experimental & Molecular Medicine. 52 (8), 1178-1184 (2020).
  21. Firulli, B. A., Firulli, A. B. Partially penetrant cardiac neural crest defects in Hand1 Phosphomutant mice: Dimer choice that is not so critical. Pediatric Cardiology. 40 (7), 1339-1344 (2019).
  22. Choi, Y. H., Choi, H. J., Lee, K. Y., Oh, J. W. Akt1 regulates phosphorylation and osteogenic activity of Dlx3. Biochemical and Biophysical Research Communications. 425 (4), 800-805 (2012).
  23. Jeong, H. M., et al. Akt phosphorylates and regulates the function of Dlx5. Biochemical and Biophysical Research Communications. 409 (4), 681-686 (2011).
  24. Seo, J. H., et al. Calmodulin-dependent kinase II regulates Dlx5 during osteoblast differentiation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 384 (1), 100-104 (2009).
  25. Gou, Y., Zhang, T., Xu, J. Transcription factors in craniofacial development: From receptor signaling to transcriptional and epigenetic regulation. Current Topics in Developmental Biology. 115, 377-410 (2015).
  26. Schock, E. N., LaBonne, C. Sorting sox: Diverse roles for sox transcription factors during neural crest and craniofacial development. Frontiers in Physiology. 11, 606889 (2020).
  27. Dennison, B. J. C., Larson, E. D., Fu, R., Mo, J., Fantauzzo, K. A. Srsf3 mediates alternative RNA splicing downstream of PDGFRalpha signaling in the facial mesenchyme. Development. 148 (14), (2021).
  28. Stamm, S. Regulation of alternative splicing by reversible protein phosphorylation. Journal of Biological Chemistry. 283 (3), 1223-1227 (2008).
  29. Szabo, A., Mayor, R. Mechanisms of neural crest migration. Annual Review of Genetics. 52, 43-63 (2018).
  30. Kindberg, A. A., Bush, J. O. Cellular organization and boundary formation in craniofacial development. Genesis. 57 (1), 23271 (2019).
  31. Faundes, V., et al. Raine syndrome: an overview. European Journal of Medical Genetics. 57 (9), 536-542 (2014).
  32. Bush, J. O., Soriano, P. Ephrin-B1 forward signaling regulates craniofacial morphogenesis by controlling cell proliferation across Eph-ephrin boundaries. Genes & Development. 24 (18), 2068-2080 (2010).
  33. Fantauzzo, K. A., Soriano, P. Generation of an immortalized mouse embryonic palatal mesenchyme cell line. PLoS One. 12 (6), 0179078 (2017).
  34. Goering, J. P., Isai, D. G., Czirok, A., Saadi, I. Isolation and time-lapse imaging of primary mouse embryonic palatal mesenchyme cells to analyze collective movement attributes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (168), e62151 (2021).
  35. JoVE. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. Science Education Database. , (2022).
  36. . Analyzing gels and western blots with ImageJ Available from: https://lukemiller.og/index.php/2010/11/analyzing-gels-and-western-blots-with-images-j/ (2010)
  37. Fantauzzo, K. A., Soriano, P. PI3K-mediated PDGFRalpha signaling regulates survival and proliferation in skeletal development through p53-dependent intracellular pathways. Genes & Development. 28 (9), 1005-1017 (2014).
  38. Wang, Y., et al. Rapid alteration of protein phosphorylation during postmortem: implication in the study of protein phosphorylation. Scientific Reports. 5, 15709 (2015).
  39. Sharma, S. K., Carew, T. J. Inclusion of phosphatase inhibitors during Western blotting enhances signal detection with phospho-specific antibodies. Analytical Biochemistry. 307 (1), 187-189 (2002).
  40. Bass, J. J., et al. An overview of technical considerations for Western blotting applications to physiological research. Scandinavian Journal of Medicine & Science in Sports. 27 (1), 4-25 (2017).
  41. Hooper, J. E., et al. Systems biology of facial development: contributions of ectoderm and mesenchyme. 발생학. 426 (1), 97-114 (2017).
  42. Childs, C. B., Proper, J. A., Tucker, R. F., Moses, H. L. Serum contains a platelet-derived transforming growth factor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (17), 5312-5316 (1982).
  43. Swaisgood, H. E. Review and update of casein chemistry. Journal of Dairy Science. 76 (10), 3054-3061 (1993).
  44. Silva, J. M., McMahon, M. The fastest Western in town: a contemporary twist on the classic Western blot analysis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (84), e51149 (2014).
  45. Salinovich, O., Montelaro, R. C. Reversible staining and peptide mapping of proteins transferred to nitrocellulose after separation by sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis. Analytical Biochemistry. 156 (2), 341-347 (1986).

Tags

Protein LysatesPhosphoprotein AnalysisFacial ProcessesPalatal Mesenchyme CellsCraniofacial DevelopmentMouse EmbryosProtein IsolationPhosphatase InhibitorsProtein PhosphorylationDissectionCell Culture
check_url/kr/63834?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Rogers, M. A., Dennison, B. J. C., Fantauzzo, K. A. Isolation of Whole Cell Protein Lysates from Mouse Facial Processes and Cultured Palatal Mesenchyme Cells for Phosphoprotein Analysis. J. Vis. Exp. (182), e63834, doi:10.3791/63834 (2022).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image