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발생학

Isolamento de Lysatos de Proteína Celular Inteira de Processos Faciais de Camundongos e Células de Mesenchyme Palatal cultivadas para análise de fosfoproteína

Published: April 01, 2022
doi:
10.3791/63834
, ,
1Department of Craniofacial Biology, School of Dental Medicine,University of Colorado Anschutz Medical Campus

Summary

O protocolo apresenta um método para isolar os lises de proteínas celulares inteiras de processos faciais de embriões de camundongos dissecados ou células de mesenquime palatina embrionárias cultivadas e realizar posteriormente manchas ocidentais para avaliar os níveis de proteína fosfoilada.

Abstract

O desenvolvimento craniofacial dos mamíferos é um processo morfológico complexo durante o qual várias populações celulares se coordenam para gerar o esqueleto frontonasal. Essas alterações morfológicas são iniciadas e sustentadas através de diversas interações de sinalização, que muitas vezes incluem fosforilação proteica por quinases. Aqui, são fornecidos dois exemplos de contextos fisiologicamente relevantes para estudar a fosforilação de proteínas durante o desenvolvimento craniofacial dos mamíferos: processos faciais de camundongos, em particular processos maxilarres E11,5, e células de mesenquime palatina palatina embrionárias cultivadas derivadas de prateleiras palatais secundárias E13,5. Para superar a barreira comum da desfosforilação durante o isolamento de proteínas, são discutidas adaptações e modificações nos métodos laboratoriais padrão que permitem o isolamento das fosfoproteínas. Além disso, as melhores práticas são fornecidas para análise adequada e quantificação de fosfoproteínas após a mancha ocidental de lises de proteínas celulares inteiras. Essas técnicas, particularmente em combinação com inibidores farmacológicos e/ou modelos genéticos murinas, podem ser usadas para obter maior percepção sobre a dinâmica e os papéis de várias fosfoproteínas ativas durante o desenvolvimento craniofacial.

Introduction

O desenvolvimento craniofacial dos mamíferos é um processo morfológico complexo durante o qual várias populações celulares se coordenam para gerar o esqueleto frontonasal. No camundongo, esse processo começa no dia embrionário (E) 9.5 com a formação da proeminência frontonasal e pares de processos maxilares e mandibulares, cada um dos quais contém células de crista neural craniana pós-migratória. Os processos nasais laterais e mediais surgem do destaque frontonasal com o aparecimento das covas nasais e eventualmente se fundem para formar as narinas. Além disso, os processos nasais medial e processos maxilarários se fundem para gerar o lábio superior. Simultaneamente, a palatogênese é iniciada com a formação de crescimentos distintos – as prateleiras palatais secundárias – do lado oral dos processos maxilares em E11,5. Com o tempo, as prateleiras palatais crescem para baixo em ambos os lados da língua, elevam para uma posição oposta acima da língua, e eventualmente se fundem na linha média para formar um paladar contínuo que separa as cavidades nasais e orais por E16,51.

Essas alterações morfológicas ao longo do desenvolvimento craniofacial são iniciadas e sustentadas através de diversas interações de sinalização, que muitas vezes incluem fosforilação proteica por quinases. Por exemplo, receptores de membrana celular, como subfamílias de fator de crescimento transformador (TGF)-β receptores, incluindo receptores de proteína morfogenética óssea (BMPRs), e várias famílias receptoras de tyrosina quinase (RTK), são autofosforilados sobre ligação de ligante e ativação em células de crista neural craniana 2,3,4 . Além disso, o receptor de transmembrano acoplado à proteína G Smoothened torna-se fosforilado em células de crista neural craniana e ectoderme craniofacial a jusante do ligante de ouriço Sonic (SHH) ligado ao receptor Patched1, resultando em acúmulo de liso na membrana ciliar e ativação da via SHH5. Tais interações ligantes-receptor podem ocorrer através de sinalização autocrina, paracrina e/ou justacrina em contextos craniofaciais. Por exemplo, BMP6 é conhecido por sinalizar de forma autocririna durante a diferenciação de condrocito6, enquanto o fator de crescimento do fibroblasto (FGF) 8 é expresso no arco faringeal e se liga aos membros da família FGF de RTKs expressas no arco faringeal mesenchyme de forma paracrina para o início do padrão e crescimento do arco faringeal7, 8,9,10. Além disso, a sinalização de Entalhe é ativada em condrócitos e osteoblastos durante o desenvolvimento esquelético craniofacial através da sinalização justacririna quando os ligantes delta e/ou irregulares se ligam aos receptores de notch transmembrano em células vizinhas, que são posteriormente cortados e fosfoilados11. No entanto, existem outros pares de ligantes e receptores importantes para o desenvolvimento craniofacial que têm a flexibilidade de funcionar tanto na sinalização autocrina quanto na paracrina. Como exemplo, durante a morgênese dentária murina, o fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF)-AA foi demonstrado para sinalizar de forma autocrina para ativar o RTK PDGFRα no epitélio do órgão de esmalte12. Em contraste, nos processos faciais murinos durante a gestação média, as transcrições que codificam os ligantes PDGF-AA e PDGF-CC são expressas no ectoderme craniofacial, enquanto o receptor PDGFRα é expresso no mesenchyme craniano-derivado, resultando em sinalização paracrina 13,14,15, 16,17 . Independentemente do mecanismo de sinalização, esses eventos de fosforilação receptora frequentemente resultam no recrutamento de proteínas adaptadoras e/ou moléculas de sinalização, que frequentemente se tornam fosforilatos para iniciar cascatas de quinase intracelular, como a via de quinase de proteína ativada por mitogênio (MAPK)18,19.

Os efeitos intracelulares terminais dessas cascatas podem então fosforilarar uma matriz de substratos, como fatores de transcrição, RNA-binding, citoskeletal e proteínas de matriz extracelular. Runx220, Hand121, Dlx3/5 22,23,24, Gli1-3 25 e Sox926 estão entre os fatores de transcrição fosfoilados no contexto do desenvolvimento craniofacial. Essa modificação pós-translacional (PTM) pode afetar diretamente a suscetibilidade a PTMs alternativos, dimerização, estabilidade, decote e/ou afinidade de vinculação de DNA, entre outras atividades 20,21,25,26. Além disso, a proteína de ligação de RNA Srsf3 é fosfoilada no contexto do desenvolvimento craniofacial, levando à sua translocação nuclear27. Em geral, a fosforilação de proteínas de ligação de RNA tem sido demonstrada para afetar sua localização subcelular, interações proteína-proteína, ligação RNA e/ou especificidade de sequência28. Além disso, a fosforilação da actomiose pode levar a rearranjos citosqueletal em todo o desenvolvimento craniofacial29,30, e a fosforilação de proteínas da matriz extracelular, como pequenas ligatérias integrinas ligadas à N-proteína, contribui para a biomineralização durante o desenvolvimento esquelético31. Através dos exemplos acima e numerosos, é evidente que há amplas implicações para a fosforilação proteica durante o desenvolvimento craniofacial. Adicionando um nível adicional de regulação, a fosforilação proteica é ainda mais modulada por fosfattases, que neutralizam as quinases removendo grupos de fosfato.

Esses eventos de fosforilação nos níveis de receptor e molécula de efeitos são críticos para a propagação de vias de sinalização e, em última instância, resultam em mudanças na expressão genética no núcleo, conduzindo atividades celulares específicas, como migração, proliferação, sobrevivência e diferenciação, que resultam na formação adequada da face mamífera. Dada a especificidade do contexto das interações proteicas com quinases e fosfates, as mudanças resultantes nos PTMs e seus efeitos sobre a atividade celular, é fundamental que esses parâmetros sejam estudados em um cenário fisiologicamente relevante para obter uma compreensão completa da contribuição dos eventos fosforilação para o desenvolvimento craniofacial. Aqui, são fornecidos exemplos de dois contextos para estudar a fosforilação de proteínas e, assim, a ativação de vias de sinalização durante o desenvolvimento craniofacial dos mamíferos: processos faciais de camundongos, em particular processos maxilares E11,5, e células mesenquima palatinas embrionárias cultivadas derivadas de prateleiras palatais secundárias E13,5 – ambas primárias32 e imortal33 . Na E11.5, os processos maxilarianos estão em processo de fusão com os processos nasais laterais e mediais1, representando assim um ponto de tempo crítico durante o desenvolvimento craniofacial do rato. Além disso, processos maxilares e células derivadas das prateleiras palatais foram escolhidos aqui porque essas últimas estruturas são derivadas da primeira, proporcionando aos pesquisadores a oportunidade de interrogar a fosforilação proteica em ambientes vivos e in vitro em contextos relacionados. No entanto, este protocolo também é aplicável a processos faciais alternativos e pontos de tempo de desenvolvimento.

Um problema crítico no estudo de proteínas fosfoiladas é que elas são facilmente desfosforiladas durante o isolamento de proteínas por fosfattases ambientais abundantes. Para superar essa barreira, são discutidas adaptações e modificações nos métodos laboratoriais padrão que permitem o isolamento de proteínas fosforilaladas. Além disso, as melhores práticas são fornecidas para análise adequada e quantificação de proteínas fosforilalatadas. Essas técnicas, particularmente em combinação com inibidores farmacológicos e/ou modelos genéticos murinos, podem ser usadas para obter maior visão sobre a dinâmica e os papéis de várias vias de sinalização ativas durante o desenvolvimento craniofacial.

Protocol

Todos os procedimentos envolvendo animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) do Campus Médico da Universidade do Colorado Anschutz e realizados em conformidade com as diretrizes e regulamentos institucionais. Camundongos 129S4 femininos com 1,5-6 meses de idade e alojados a uma temperatura sub-termoneutral de 21-23 °C foram usados para colheitas de embriões. Um fluxo de trabalho esquemático do protocolo está representado na Figura 1. Consulte…

Representative Results

Ao tentar caracterizar a fosforilação de proteínas isoladas dos processos faciais do camundongo e/ou células de mesenquima palatal cultivadas, os resultados representativos revelarão idealmente uma faixa distinta e reprodutível após a mancha ocidental com um anticorpo antifosfoproteína que corre na altura ou perto da altura da faixa de proteína total correspondente (Figura 3 ). No entanto, se ocorrer uma fosforilação extensiva da proteína, pode haver uma ligeira mudança ascenden…

Discussion

O protocolo descrito aqui permite que os pesquisadores testem eventos críticos de sinalização dependentes de fosforilação durante o desenvolvimento craniofacial de forma robusta e reprodutível. Existem várias etapas críticas neste protocolo que garantem a coleta adequada de dados e análise dos resultados. Seja isolando fosfoproteínas de processos faciais de camundongos e/ou células de mesenquime palatal cultivadas, é imperativo mover-se de forma rápida e eficiente, mantendo todos os reagentes e materiais no …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Os ratos 129S4 foram um presente do Dr. Philippe Soriano, da Escola de Medicina Icahn do Monte Sinai. Este trabalho foi apoiado com recursos dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH)/Instituto Nacional de Pesquisa Odontológica e Craniofacial (NIDCR) R01 DE027689 e K02 DE028572 para K.A.F., F31 DE029976 a M.A.R. e F31 DE029364 para B.J.C.D.

Materials

Equipment
Block for mini dry bath Research Products International Corp 400783
ChemiDoc XRS+ imaging system with Image Lab software Bio-Rad 1708265 chemiluminescence imager
CO2 incubator, air jacket VWR 10810-902
Dissecting board, 11 x 13 in Fisher Scientific 09 002 12
Electrophoresis cell, 4-gel, for mini precast gels with mini trans-blot module Bio-Rad 1658030
Hybridization oven Fisher Scientific UVP95003001
Microcentrifuge 5415 D with F45-24-11 rotor (Eppendorf) Sigma Aldrich Z604062
Mini dry bath Research Products International Corp 400780
Orbital shaker VWR 89032-092
pH meter VWR 89231-662
Power supply for SDS-PAGE Bio-Rad 1645050
Rectangular ice pan, maxi 9 L Fisher Scientific 07-210-093
Stemi 508 stereo microscope with stand K LAB, LED ring light Zeiss 4350649020000000 dissecting microscope
Timer VWR 62344-641
Tube revolver Fisher Scientific 11 676 341
Vortex mixer Fisher Scientific 02 215 414
Water bath VWR 89501-472
Western blot box Fisher Scientific NC9358182
Materials
Cell culture dishes, 6 cm Fisher Scientific 12-565-95
Cell culture plates, 12 well Fisher Scientific 07-200-82
Cell lifters Fisher Scientific 08-100-240
CO2 Airgas CD USP50
Conical tubes, polypropylene, 50 mL Fisher Scientific 05-539-13
Dumont #5 fine forceps Fine Science Tools 11254-20
Embryo spoon Fine Science Tools 10370-17
Microcentrifuge tubes, 0.5 mL VWR 89000-010
Microcentrifuge tubes, 1.5 mL VWR 20170-038
Pasteur pipet, 5.75" Fisher Scientific 13-678-6A
Pasteur pipet, 9" VWR 14672-380
Petri dishes, 10 cm Fisher Scientific 08-757-100D
Petri dishes, 35 mm Fisher Scientific FB0875711YZ
Pouches, transparent, polyethylene lining Fisher Scientific 01-812-25B
PVDF membrane Fisher Scientific IPVH00010
Semken forceps Fine Science Tools 11008-13
Small latex bulb, 2 mL VWR 82024-554
Surgical scissors Fine Science Tools 14002-12
Syringe filter, 25 mm, 0.2 μm pore size Fisher Scientific 09-740-108
Syringe with luer tip, 10 mL VWR BD309604
Transfer pipet Fisher Scientific 13-711-22
Western blot cassette opening lever Bio-Rad 4560000
Whatmann 3MM chr chromatography paper Fisher Scientific 05-714-5
Reagents
4-15% Precast protein gels, 10-well, 30 µL Bio-Rad 4561083
β-glycerophosphate disodium salt hydrate Sigma Aldrich G5422-25G stock concentration 1 M
β-mercaptoethanol Sigma Aldrich M3148-100ML
Bovine serum albumin, fraction V, heat shock tested Fisher Scientific BP1600-100
Bromophenol blue Fisher Scientific AC403140050
Complete mini protease inhibitor cocktail Sigma Aldrich 11836153001 stock concentration 25x
DC protein assay kit II Bio-Rad 500-0112
DMEM, high glucose Gibco 11965092
E7, mouse monoclonal beta tubulin primary antibody, concentrate 0.1 mL Developmental Studies Hybridoma Bank E7 1:1,000
ECL western blotting substrate Fisher Scientific PI32106 low picogram range
ECL western blotting substrate Genesee Scientific 20-302B low femtogram range
Electrophoresis buffer, 5 L Bio-Rad 1610772 stock concentration 10x
Ethanol, 200 proof, 1 gallon Decon Laboratories, Inc. 2705HC EtOH
Ethylenediaminetetraacetic acid, Di Na salt dihydr. (crystalline powd./electrophor.) Fisher Scientific BP120-500 EDTA
Fetal bovine serum, characterized, US origin, 500 mL HyClone SH30071.03
Glycerol (certified ACS) Fisher Scientific G33-4
HRP-conjugated secondary antibody, goat anti-mouse IgG Jackson ImmunoResearch Laboratories 115-035-146 1:20,000
HRP-conjugated secondary antibody, goat anti-rabbit IgG Jackson ImmunoResearch Laboratories 111-035-003 1:20,000
Hydrochloric acid solution, 6N (certified) Fisher Scientific SA56-500 HCl
Igepal Ca – 630 non-ionic detergent Fisher Scientific ICN19859650 Nonidet P-40
Isopropanol (HPLC) Fisher Scientific A451-1
L-glutamine Gibco 25030081 stock concentration 200 mM
Methanol Fisher Scientific A454-4
p44/42 MAPK (Erk1/2) primary antibody Cell Signaling Technology 9102S 1:1,000; anti-Erk1/2
PDGF-BB recombinant ligand, rat Fisher Scientific 520BB050
PDGF Receptor β primary antibody Cell Signaling Technology 3169S 1:1,000
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122 stock concentration 100 U/mL, 100 µg/mL
Phenylmethanesulfonyl fluoride, 99% Fisher Scientific AC215740100 PMSF; stock concentration 100 mM
Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) primary antibody Cell Signaling Technology 9101S 1:1,000, anti-phospho-Erk1/2
Phospho-PDGF Receptor α /PDGF Receptor β primary antibody Cell Signaling Technology 3170S 1:1,000
Potassium chloride (white crystals) Fisher Scientific BP366-500 KCl
Potassium phosphate monobasic (white crystals) Fisher Scientific BP362-500 KH2PO4
SDS solution, 10% Bio-Rad 161-0416
Sodium chloride (crystalline/biological,certified) Fisher Scientific S671-3 NaCl
Sodium fluoride (powder/certified ACS) Fisher Scientific S299-100 NaF; aliquot for one time use; stock concentration 1 M
Sodium orthovanadate, 99% Fisher Scientific AC205330500 Na3VO4; stock concentration 100 mM
Sodium phosphate dibasic anhydrous (granular or powder/certified ACS) Fisher Scientific S374-500 Na2HPO4
Tissue culture PBS Fisher Scientific 21-031-CV
Transfer buffer, 5 L Bio-Rad 1610771 stock concentration 10x
Tris base (white crystals or crystalline powder/molecular biology) Fisher Scientific BP152-1
Trypsin BioWorld 21560033
Tween 20 Fisher Scientific BP337-500
Western blot molecular weight marker Bio-Rad 1610374
Software
ImageJ software National Institutes of Health
Animals
Female 129S4 mice gift of Dr. Philippe Soriano, Icahn School of Medicine at Mount Sinai
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Rogers, M. A., Dennison, B. J. C., Fantauzzo, K. A. Isolation of Whole Cell Protein Lysates from Mouse Facial Processes and Cultured Palatal Mesenchyme Cells for Phosphoprotein Analysis. J. Vis. Exp. (182), e63834, doi:10.3791/63834 (2022).
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