Denne protokollen beskriver arbeidsflyten for metabolsk merking av senescent og ikke-delende celler med pulserende SILAC, umålt massespektrometrianalyse og en strømlinjeformet beregning av proteinhalvvanser.
Voksende bevis har vist at opphopning av senescent celler i sentralnervesystemet bidrar til nevrodegenerative lidelser som Alzheimers og Parkinsons sykdommer. Cellulær senescence er en tilstand av permanent celle syklus arrestasjon som vanligvis oppstår som svar på eksponering for sub-dødelige påkjenninger. Men som andre ikke-splittende celler forblir senescentceller metabolsk aktive og utfører mange funksjoner som krever unike transkripsjons- og translasjonskrav og utbredte endringer i de intracellulære og utskilte proteomene. Forstå hvordan proteinsyntese og forfallshastigheter endres under senescence kan belyse de underliggende mekanismene for cellulær senescence og finne potensielle terapeutiske veier for sykdommer forverret av senescent celler. Dette dokumentet beskriver en metode for proteomskala evaluering av protein halveringstider i ikke-splittende celler ved hjelp av pulserende stabil isotopmerking av aminosyrer i cellekultur (pSILAC) i kombinasjon med massespektrometri. pSILAC innebærer metabolsk merking av celler med stabile tunge isotopholdige versjoner av aminosyrer. Kombinert med moderne massespektrometri tilnærminger, pSILAC muliggjør måling av proteinomsetning av hundrevis eller tusenvis av proteiner i komplekse blandinger. Etter metabolsk merking kan omsetningsdynamikken til proteiner bestemmes basert på relativ berikelse av tunge isotoper i peptider oppdaget av massespektrometri. I denne protokollen er en arbeidsflyt beskrevet for generering av senescent fibroblastkulturer og tilsvarende arresterte quiescent fibroblaster, samt et forenklet, engangspunkt pSILAC-merkingstidskurs som maksimerer dekningen av forventede proteinomsetningshastigheter. Videre presenteres en rørledning for analyse av pSILAC massespektrometridata og brukervennlig beregning av proteinforringelseshastigheter ved hjelp av regneark. Anvendelsen av denne protokollen kan utvides utover senescent celler til alle ikke-splittende dyrkede celler som nevroner.
Senescence ble først identifisert som en tilstand av ubestemt vekst arrest utstilt av kultiverte primærceller etter å ha nådd replikert utmattelse1. Det har siden blitt vist at senescence kan oppstå som svar på mange cellulære fornærmelser, inkludert gentoksiske, mitokondrie og onkogene påkjenninger, blant andre2. Mens senescence har flere fysiologisk viktige roller, for eksempel tumorundertrykking og sårheling, er akkumulering av senescentceller under aldring forbundet med en rekke skadelige effekter på helse3, inkludert flere nevrodegenerative forhold 4,5,6. Cellulær senescence forekommer i flere hjernecelletyper, inkludert nevroner 7,8,9,10, astrocytter11, mikroglia12 og oligodendrocyttforløpere13, og bidrar til nevrodegenerasjon og kognitiv dysfunksjon. Amyloid beta oligomers, et av kjennetegnene på Alzheimers sykdom14, har vist seg å akselerere nevronal senescence 13,15,16. En økt forekomst av senescent celler har også vært forbundet med Parkinsons sykdom17, spesielt som følge av miljøstressorer11,18. Det er viktig at selektiv eliminering av senescentceller i prekliniske modeller forlenger levetiden og reduserer en rekke aldersrelaterte sykdommer 3,5,12 og forbedrer kognitive underskudd 8,11,12,13. Senescent celler har dermed dukket opp som lovende terapeutiske mål for behandling av mange aldersrelaterte forhold.
Mye av den skadelige effekten av senescentceller er forårsaket av senescence-assosiert sekretorisk fenotype (SASP), en kompleks blanding av bioaktive molekyler utskilt av senescent celler som kan forårsake lokal betennelse, angiogenese, ødeleggelse av den ekstracellulære matrisen, og forplantning av senescence i omkringliggende vev 19,20,21 . SASP representerer også et interessant biologisk fenomen av senescence fordi det krever en betydelig transkripsjons- og translasjonsinnsats under en tilstand av cellesyklusarrest. Faktisk har senescent celler vist seg å vise nedgang i ribosomet biogenese 22,23,24 som bør redusere proteinsyntesen. I stedet oversetter senescentceller robust noen proteiner, spesielt SASP-faktorer, og påvirker metabolismen av omkringliggende vev25. Dermed er det stor interesse for å forstå hvordan senescentceller som gjennomgår en permanent cellesyklusstans fortsetter å opprettholde protein homeostase, samtidig som de robust uttrykker SASP-faktorer og andre utvalgte proteiner.
Denne metoden beskriver hvordan du bruker massespektrometri og pulserende stabil isotopmerking av aminosyrer i cellekultur (pSILAC) for å globalt måle halvering av proteiner i senescentceller i proteome-bred skala. I tradisjonell SILAC er dyrkede celler helt metabolsk merket med tunge og lette ikke-radioaktive isotoper av aminosyrer for nedstrøms analyse av proteinoverflod. Denne metoden har tidligere blitt brukt til å vurdere overflodsendringer omfattende og kvantitativt i SASP av kultiverte fibroblaster26. I pSILAC er celler tilsvarende metabolsk merket med en puls av tung isotop som følger forhåndsmerking med lett isotop, og deretter høstes med ett eller flere tidsintervaller. Graden av inkorporering av tung isotop i referanse til eksisterende lysisotoper brukes deretter til å beregne relative proteinomsetningshastigheter. Vanligvis brukes isotoper av arginin og lysin fordi trypsin cleaves på disse rester; Dermed vil alle peptider fra standard fordøyelse potensielt inneholde den tunge etiketten. Par peptider som bare varierer ved tilstedeværelse eller fravær av tung lysin eller arginin er kjemisk identiske og kan differensieres og kvantifiseres av et massespektrometer. Etter massespektrometrianalyse kan peptider identifiseres som nylig syntetisert eller eksisterende basert på tilstedeværelsen eller fraværet av den isotopiske etiketten i de resulterende peptididentifikasjonene. Proteinomsetningshastigheter kan deretter bestemmes ved å tilpasse forholdet mellom tunge (13 C-15N) over lette (12 C-14N) peptider for et gitt protein til kinetiske modeller for eksponentiell vekst eller forfall27,28. pSILAC har blitt brukt i flere sammenligninger av proteinomsetningshastigheter 29,30,31,32 og er for tiden den mest omfattende og høygjennomstrømningsmetoden for måling av protein halveringstiden.
Denne protokollen beskriver utarbeidelsen av senescent celler parallelt med tilsvarende vekst-arresterte passivitetsceller i kultur, etterfulgt av metabolsk merking med pSILAC. Celler høstes deretter, homogeniseres til lysater og behandles for massespektrometrioppkjøp og analyse. Dataene hentet fra massespektrometri brukes deretter til å bestemme protein halveringstider ved hjelp av en forenklet kvantitativ metode som bruker ett enkelt tidspunkt og halveringsberegninger utført i et regneark. Ved hjelp av denne tilnærmingen kan estimater av protein halveringstiden måles på en omfattende og kvantitativ måte som er mer autentisk for uforstyrrede cellulære forhold enn protokoller som bruker blokkeringer av proteinsyntese eller omsetning.
pSILAC er en kraftig teknikk som muliggjør global kvantifisering av proteinomsetningshastigheter på tvers av flere cellulære forhold. Dette dokumentet beskriver bruken av pSILAC for å sammenligne globalt protein halveringstid mellom senescent og quiescent celler, inkludert instruksjoner for fremstilling av senescent og quiescent celler, SILAC merking og høsting, og til slutt analyse ved hjelp av DDA masse spektrometri. I tillegg er en to-trinns test beskrevet for validering av senescence fenotype ved hjelp av SA-βGal og RT-qPCR analyse av et panel av mRNAs koding senescence-assosierte proteiner. I tillegg til validering av senescence med de to tilnærmingene som er beskrevet, kan en tredje validering av senescence utføres etter massespektrometrianalyse ved å lete etter endringer i kjente senescence markører mellom senescent og quiescent celler på proteomisk nivå. Senescence-assosierte proteiner som forventes å bli forhøyet inkluderer p16, p21 og BCL2, blant andre, beskrevet andre steder44,45. I protokollen beskrevet ovenfor ble ioniserende stråling brukt til induksjon av senescence og serum sult for passiviserende celler. For induksjon av senescence er det flere alternativer tilgjengelig, og det er betydelig heterogenitet blant dem 41,42,46. For tiden er det ingen senescent metode som regnes som den “mest fysiologiske”, så valget av senescent inducer er i stor grad basert på konteksten av eksperimentet. Eksperimenter med mål om å si et generelt fenomen om senescence anbefales imidlertid å bruke minst to forskjellige senescent indusere. Å diskutere omfanget av senescence paradigmer er utenfor omfanget av dette papiret, men noen vanlige metoder for å indusere senescence inkluderer å utløse DNA-skade (IR, doxorubicin, replikerende utmattelse), uttrykke onkogene proteiner (HRAS, BRAF), og forstyrre mitokondrier funksjon2.
I tillegg til valg av senescent induser, er valg av kontrollceller en like viktig vurdering. Senescent celler er per definisjon under ubestemt vekst arrest, så en sammenligning med andre vekst-arresterte celler blir ofte valgt. For pSILAC er celler som er arrestert i cellesyklusen generelt å foretrekke fordi de ikke replikerer og dermed er lettere å bruke til beregninger av proteinhalvtid47. Men siden kultiverte celler ofte vil beholde noen skilleceller, er det viktig at metodene som brukes til å indusere cellesyklusstans, gir så homogen respons som mulig for å minimere feil fra celler som fortsatt sprer seg. For å beregne proteinforringelsesrater for sykkelceller ved hjelp av pSILAC krever ytterligere beregninger for å kompensere for hvor raskt protein fortynnes i datterceller27. Imidlertid er passiv vekstarrest i seg selv ikke uten komplikasjoner. Det er to generelle metoder for cellesyklusstans: serummangel og kontakthemming48. Ikke alle celler kan gjøres passiviserende gjennom kontakthemming, selv om noen fibroblaster har vist seg å demonstrere passivens etter flere dager med dyrking49. Denne metoden brukte serummangel fordi den er mer vanlig å bruke til sammenligninger av senescentceller, selv om det krever at senescentcellen er tilsvarende serumberøvet for nøyaktige sammenligninger. Serum aktiverer mTOR-komplekset, og dermed har serummangel flere nedstrømseffekter på cellen i tillegg til cellesyklusstans50. Spesielt har senescent celler vist seg å vise en redusert SASP ved serummangel eller mTOR-hemming51,52.
Et annet viktig poeng å vurdere i pSILAC er hvor mange tidspunkter å teste. Denne protokollen samlet celler på et enkelt tidspunkt (3 dager med lett eller tung merking), noe som betydelig forenkler den resulterende analysen. Valget av tidspunkt bør være basert på eksperimentets mål. For global analyse forventes det at 3 dager vil fange opp et flertall proteiner, selv om halveringstid for kortlivede proteiner som fullstendig omsetning innen 3 dager (alt lyssignal går tapt) ikke kan måles på dette tidspunktet. Omvendt er langlivede proteiner med svært liten omsetning på 3 dager også vanskelig å kvantifisere og vises ofte som å ha ekstremt store halveringstider (i rekkefølgen av uker) som vanligvis bare er en konsekvens av svært lite tung signalakkumulering. På grunn av det ikke-lineære forholdet mellom tunge og lette peptidsignaler kontra prosentandelen av nylig syntetisert protein på kortere og lengre tidspunkter, kan kvantiseringen av halveringstider forbedres ved å legge til flere merketidspunkter. For relative sammenligninger mellom to celletilstander, som i denne protokollen, kan en omtrentlig halveringstid være tilstrekkelig, men flere tidspunkter kan brukes til å forbedre kvantitativ nøyaktighet.
Denne protokollen beskriver hvordan du utfører en umålt DDA-basert analyse av proteinomsetning. Imidlertid kan proteinomsetningsberegningene brukes generelt på enhver oppkjøpsordning som er i stand til å utlede den relative overfloden av tunge og lette peptidpar. MS2-baserte metoder som datauavhengig anskaffelse (DIA/SWATH) kan for eksempel også brukes til beregning av omsetningsrater med hell53. I tillegg kan andre instrumenterings- og programvarerørledninger enn de som er beskrevet i denne protokollen, brukes til å utføre DDA-analyse, proteinidentifikasjon og protein kvantifisering. Når du bruker programvareplattformer for protein kvantifisering som Skyline for å trekke ut peptidtoppområder, anbefales det å manuelt inspisere ekstraherte ionkromatogrammer i dokumentarbeidsområdet, identifisere topper som feilaktig ble integrert og ikke-kvantitative topper, og kuratere dokumentet deretter. En omfattende samling av opplæringsprogrammer er tilgjengelig online for Skyline (skyline.ms).
pSILAC representerer en av de mest ideelle metodene for global kvantifisering av proteinhalvliv i dyrkede celler på grunn av overlegen multipleksing (proteomdekning) og gjennomstrømning. Mens pSILAC ikke gir direkte syntese eller nedbrytning, siden endringen i lett og tungt signal skyldes en sammenløp av faktorer, er pSILAC svært nyttig for sammenligninger mellom forhold og forskjellige celletyper. Lavgjennomstrømningsmetoder faller ofte inn i to typer: 1) behandling av celler med cykloheksimid for å blokkere proteinsyntese og høste med tidsintervaller etter tilsetning for å overvåke forfall, eller 2) behandling av celler med en hemmer av proteinforfall og høsting med tidsintervaller etter tilsetning for å overvåke opphopning av protein, og dermed utlede proteinforfallshastigheter. Begrensningen av begge metodene er at slike behandlinger uunngåelig vil føre til betydelige endringer i cellulær fysiologi. I kontrast krever pSILAC ingen betydelig inngrep og har teoretisk sett ingen påvisbare effekter på cellulær fysiologi siden isotopiske aminosyrer bare varierer med en enkelt nøytron fra deres ikke-isotopiske kolleger. Dermed representerer metoden beskrevet her for pSILAC en enkel protokoll for global måling av de mest fysiologiske proteinhalvdelene i ikke-splittende celler.
Endringer i proteinomsetning har et nært forhold til aldring, aldersrelaterte sykdommer, nevrodegenerasjon og levetid54,55. Denne protokollen beskriver en metode for å forhøre disse forholdene ved å bruke stabil isotopmerking av aminosyrer i cellekulturen for å måle proteinomsetningshastigheter i senescence-celler. Imidlertid finnes det mange analoge metoder for å utføre studier i sammenheng med aldring og nevrodegenerasjon in vivo i hele organismer som mus. Faktisk har disse studiene understreket viktigheten av å måle proteinomsetningsrater i sammenheng med aldersrelaterte sykdommer 56,57,58,59.
I denne studien skilte ribosomale proteiner og proteiner som ligger i det endoplasmiske retikulumet seg ut som to kategorier proteiner med henholdsvis redusert og økt halvering av liv i senescentceller. Mens videre analyse av steady-state nivåer er nødvendig for definitive konklusjoner, disse resultatene ytterligere tyder på at senescent celler kan unikt regulere oversettelse gjennom redusert halvering av ribosomale proteiner. Fremover vil bruk av stabile isotopmerkingsmetoder for å studere forholdet mellom cellulær senescence og neurodegeneration in vivo i musemodeller være en lovende forlengelse av isotopmerkingsmetoden beskrevet av denne protokollen.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health (NIH) og Intramural Research Program (IRP), National Institute on Aging (NIA). N.B. ble støttet av Longevity Impetus Grants, og Office of Dietary Supplements (ODS) Scholars Program. Figur 1 ble opprettet med BioRender.com.
Acetonitrile (LC-MS grade) | Grainger | AH015 | |
Ammonium Bicarbonate | Millipore-Sigma | 9830 | |
Antibiotic-Antimycotic (100x) | ThermoFisher | 15240062 | |
BCA Assay Kit | ThermoFisher | 23227 | |
Dithiothreotol (DTT) | Sigma | D9779 | |
DMEM, high glucose, HEPES | ThermoFisher | 12430112 | |
dNTP Mix | ThermoFisher | R0191 | |
Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated | ThermoFisher | 10082147 | |
Formic Acid | Sigma | 27001 | |
Gammacel 40 Exactor | Best Theratronics | Cesium Irradiator for cells | |
GlycoBlue | ThermoFisher | AM2238 | |
Iodoacetamide (IAA) | Sigma | I1149 | Light sensitive |
IMR-90 primary lung fibroblasts | ATCC | CCL-186 | |
iRT Kit (indexed retention time) | Biognosys | Ki-3002-2 | Indexed Retention Time Peptide Standards |
Isopropanol | ThermoFisher | 423835000 | |
Mascot | Matrix Science | Mascot Daemon 2.8 | Proteomic database searching software |
Maxima Reverse Transcritase (200 U/µL) | ThermoFisher | EP0742 | |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | ThermoFisher | 11140050 | |
Nano LC System | ThermoFisher | ULTIM3000RSLCNANO | |
Oasis HLB Solid Phase Extraction Cartirdges | Waters | 186000383 | |
Orbitrap Mass Spectrometer | ThermoFisher | Q Exactive HF Orbitrap | |
Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol (25:24:1), 100 mM EDTA, pH 8.0 | ThermoFisher | 327110025 | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher | 10010023 | |
Pierce SILAC Protein Quantitation Kit (Trypsin) -DMEM | ThermoFisher | A33972 | |
QuantStudio 6 Real-Time PCR System | ThermoFisher | ||
Random Hexamer Primer | ThermoFisher | SO142 | |
Senescence β-Galactosidase Staining Kit | Cell Signaling | 9860 | |
Skyline | University of Washington | Skyline-Daily v21.2.1.424 | Free and open source qantiative proteomic software. Available on www.skyline.ms |
Sonicator waterbath | Branson | CPX-952-516R | |
TRIzol Reagent | ThermoFisher | 15596018 | Referred to as phenol in text; hazardous |
TRYPle Express | ThermoFisher | 12605010 | |
Trypsin (sequencing grade) | Promega | V5113 | |
TURBO Dnase (2U/ uL) | ThermoFisher | AM2238 | |
Urea | ThermoFisher | 29700 | |
Water (LC-MS grade) | Grainger | AH365 |