फील्ड-एकत्रित मच्छरों से मच्छर से जुड़े वायरस अलगाव
Summary
अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों के व्यापक उपयोग के कारण मच्छरों में कई नया वायरस जैसे अनुक्रम पाए गए हैं। हम कशेरुक और मच्छर सेल लाइनों का उपयोग करके वायरस को अलग करने और बढ़ाने के लिए एक प्रभावी प्रक्रिया प्रदान करते हैं, जो मच्छर जनित और मच्छर-विशिष्ट वायरस सहित मच्छर से जुड़े वायरस पर भविष्य के अध्ययन के आधार के रूप में काम कर सकता है।
Abstract
अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों के व्यापक अनुप्रयोग के साथ, मच्छरों सहित आर्थ्रोपोड में कई नया वायरस जैसे अनुक्रमों की खोज की गई है। इन नए मच्छर से जुड़े वायरस की दो मुख्य श्रेणियां “मच्छर-जनित वायरस (एमबीवी)” और “मच्छर-विशिष्ट वायरस (एमएसवी)” हैं। ये नए वायरस कशेरुक और मच्छरों दोनों के लिए रोगजनक हो सकते हैं, या वे मच्छरों के साथ सहजीवी हो सकते हैं। इन वायरस के जैविक पात्रों की पुष्टि करने के लिए इकाई वायरस आवश्यक हैं। इस प्रकार, क्षेत्र-एकत्रित मच्छरों से वायरस अलगाव और प्रवर्धन के लिए यहां एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है। सबसे पहले, मच्छर के नमूने मच्छर होमोजेनेट्स के सुपरनैटेंट के रूप में तैयार किए गए थे। दो बार सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, सुपरनैटेंट को वायरस प्रवर्धन के लिए या तो मच्छर सेल लाइन सी 6/36 या कशेरुक सेल लाइन बीएचके -21 में टीका लगाया गया था। 7 दिनों के बाद, सतह पर तैरने वालों को पी 1 सुपरनैटेंट के रूप में एकत्र किया गया और -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया गया। इसके बाद, पी 1 सुपरनैटेंट को सी 6/36 या बीएचके -21 कोशिकाओं में दो बार पारित किया गया था, जबकि सेल की स्थिति की दैनिक जांच की जा रही थी। जब कोशिकाओं पर साइटोपैथोजेनिक प्रभाव (सीपीई) की खोज की गई, तो इन सुपरनैटेंट को एकत्र किया गया और वायरस की पहचान करने के लिए उपयोग किया गया। यह प्रोटोकॉल मच्छर से जुड़े वायरस पर भविष्य के शोध के लिए नींव के रूप में कार्य करता है, जिसमें एमबीवी और एमएसवी शामिल हैं।
Introduction
मच्छर महत्वपूर्ण रोगजनक आर्थ्रोपोड वैक्टर का एक समूह है। क्यूलिसाइड 1,2 परिवार में मच्छरों की लगभग 3,500 प्रजातियां हैं। उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों के विकासने दुनिया के विभिन्न हिस्सों से मच्छरों में कई नए, वायरस जैसे अनुक्रमों की खोज की है। आम तौर पर, इन मच्छर से जुड़े वायरस को दो मुख्य समूहों में वर्गीकृत किया जा सकता है: एमबीवी और एमएसवी।
एमबीवी विविध वायरस का एक समूह है जो कई मानव या पशु बीमारियों के प्रेरक एजेंट हैं, जैसे कि पीला बुखार वायरस (वाईएफवी), डेंगू वायरस (डीईएनवी), जापानी एन्सेफलाइटिस वायरस (जेईवी), वेस्ट नाइल वायरस (डब्ल्यूएनवी), और रिफ्ट वैली फीवर वायरस (आरवीएफवी)4। उन्होंने दुनिया भर में मनुष्यों और जानवरों दोनों में गंभीर रुग्णता और मृत्यु दर पैदा करके सार्वजनिक स्वास्थ्य को गंभीर रूप से खतरे में डाल दिया है। एमबीवी स्वाभाविक रूप से एक संक्रमित मच्छर से एक भोले मेजबान के साथ-साथ वायरस से संक्रमित मेजबान और एक खिलाने वाले मच्छर 5 तक संचरण के माध्यम से विभिन्न मेजबानों के बीच एक जीवन चक्र बनाए रखतेहैं। इसलिए, ये वायरस प्रयोगशाला1 में मच्छर सेल लाइनों और कशेरुक सेल लाइनों दोनों को संक्रमित कर सकते हैं।
एमएसवी, जिसमें यिचांग वायरस (वाईसीएन), क्यूलेक्स फ्लेविवायरस (सीएक्सएफवी), और चाओयांग वायरस (चाओवी) शामिल हैं, कीट-विशिष्ट वायरस 1,6,7 का एक उपसमूह हैं। हाल के वर्षों में, नए एमएसवी की खोज में वृद्धि हुई है, और इनमें से कुछ एमएसवी को एमबीवी के संचरण पर प्रभाव पाया गया है। उदाहरण के लिए, सीएक्सएफवी, जो क्यूलेक्स पिपियन्स में लगातार संक्रमण हो सकता है, प्रारंभिक चरण8 में डब्ल्यूएनवी प्रतिकृति को दबा सकता है। एक अन्य कीट-विशिष्ट फ्लेविवायरस, सेल-फ्यूजिंग एजेंट वायरस (सीएफएवी), एडीज एजिप्टी मच्छरों में डीईएनवी और जीका वायरस (जेडआईकेवी) के प्रसार को रोकने के लिए पाया गयाहै। इस प्रकार, यह प्रोटोकॉल मच्छर से जुड़े वायरस को अलग करने के लिए एक उपयोगी दृष्टिकोण है और मच्छरों से संबंधित रोगजनकों के वितरण और मच्छर जनित बीमारियों के नियंत्रण में आगे के शोध में मदद कर सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस विधि का उद्देश्य विभिन्न सेल लाइनों का उपयोग करके मच्छर से जुड़े वायरस को अलग करने के लिए एक व्यावहारिक तरीका प्रदान करना था। बैक्टीरिया या कवक द्वारा संदूषण से बचने के लिए मच्छर होमोजेनेट्स के सुप…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को वुहान विज्ञान और प्रौद्योगिकी योजना परियोजना (2018201261638501) द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| 0.22 µm membrane filter | Millipore | SLGP033RB | Polymer films with specific pore ratings.To remove cell debris and bacteria. |
| 24-well plates | CORNING | 3524 | Containers for cell |
| 75 cm2 flasks | CORNING | 430641 | Containers for cell |
| a sterile 2 mL tube with 3 mm ceramic beads | |||
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-062 | Antibiotic in the medium to prevent contamination from bacteria and fungi |
| Automated nucleic acid extraction system | NanoMagBio | S-48 | |
| BHK-21 cells | National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology | ||
| C6/36 cells | National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology | ||
| Centrifugal machine | Himac | CF16RN | Instrument for centrifugation of mosquito samples |
| CO2 | |||
| Dulbecco’s minimal essential medium (DMEM) | Gibco | C11995500BT | medium for vertebrate cell lines |
| Ebinur Lake virus | Cu20-XJ isolation | ||
| Feta Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10099141C | Provide nutrition for cells |
| high-speed low-temperature tissue homogenizer | servicebio | KZ-III-F | Instrument for grinding |
| incubator (28 °C) | Panasonic | MCO-18AC | Instrument for cell culture |
| incubator (37 °C) | Panasonic | MCO-18AC | Instrument for cell culture |
| PCR tube | |||
| penicillin-streptomycin | Gibco | 15410-122 | Antibiotic in the medium to prevent contamination from bacteria |
| Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B Solution | Gibco | 15240096 | |
| Refrigerator (-80 °C) | sanyo | MDF-U54V | |
| Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI) | Gibco | C11875500BT | medium for mosiquto cell lines |
| Screw cap storage tubes (2 mL) | biofil | FCT010005 | |
| sterile pestles | Tiangen | OSE-Y004 | Consumables for grinding |
| TGrinder OSE-Y30 electric tissue grinder | Tiangen | OSE-Y30 | Instrument for grinding |
| The dissecting microscope | ZEISS | stemi508 | |
| the light traps MXA-02 | Maxttrac | ||
| The mosquito absorbing machine | Ningbo Bangning | ||
| The pipette tips | Axygen | TF | |
| The QIAamp viral RNA mini kit | QIAGEN | 52906 | |
| Tweezers | Dumont | 0203-5-PO |
References
- Xia, H., Wang, Y., Atoni, E., Zhang, B., Yuan, Z. Mosquito-associated viruses in China. Virologica Sinica. 33 (1), 5-20 (2018).
- Atoni, E., et al. A dataset of distribution and diversity of mosquito-associated viruses and their mosquito vectors in China. Scientific Data. 7 (1), 342 (2020).
- Atoni, E., et al. The discovery and global distribution of novel mosquito-associated viruses in the last decade (2007-2017). Reviews in Medical Virology. 29 (6), 2079 (2019).
- Xia, H., et al. Comparative metagenomic profiling of viromes associated with four common mosquito species in China. Virologica Sinica. 33 (1), 59-66 (2018).
- Ong, O. T. W., Skinner, E. B., Johnson, B. J., Old, J. M. Mosquito-borne viruses and non-human vertebrates in Australia: A review. Viruses. 13 (2), 265 (2021).
- Agboli, E., Leggewie, M., Altinli, M., Schnettler, E. Mosquito-specific viruses-transmission and interaction. Viruses. 11 (9), 873 (2019).
- Halbach, R., Junglen, S., van Rij, R. P. Mosquito-specific and mosquito-borne viruses: evolution, infection, and host defense. Current Opinion in Insect Science. 22, 16-27 (2017).
- Bolling, B. G., Olea-Popelka, F. J., Eisen, L., Moore, C. G., Blair, C. D. Transmission dynamics of an insect-specific flavivirus in a naturally infected Culex pipiens laboratory colony and effects of co-infection on vector competence for West Nile virus. Virology. 427 (2), 90-97 (2012).
- Baidaliuk, A., et al. Cell-fusing agent virus reduces arbovirus dissemination in Aedes aegypti mosquitoes in vivo. Journal of Virology. 93 (18), 00715-00719 (2019).
- Atoni, E., et al. Metagenomic virome analysis of Culex mosquitoes from Kenya and China. Viruses. 10 (1), 30 (2018).
- Xia, H., et al. First isolation and characterization of a group C Banna virus (BAV) from Anopheles sinensis mosquitoes in Hubei, China. Viruses. 10 (10), 555 (2018).
- Shi, C., et al. Stability of the virome in lab- and field-collected Aedes albopictus mosquitoes across different developmental stages and possible core viruses in the publicly available virome data of Aedes mosquitoes. mSystems. 5 (5), 00640 (2020).
- Zhou, M., Chu, H. . Handbook for Classification and Identification of Main Vectors. , (2019).
- Wang, G., et al. Identifying the main mosquito species in China based on DNA barcoding. Plos One. 7 (10), (2012).
- Ratnasingham, S., Hebert, P. D. N. Bold: The Barcode of Life Data System (www.barcodinglife.org). Molecular Ecology Notes. 7 (3), 355-364 (2007).
- Huang, Y., et al. In vitro and in vivo characterization of a new strain of mosquito Flavivirus derived from Culicoides. Viruses. 14 (6), 1298 (2022).
- Zhao, L., et al. Characterization of a novel Tanay virus isolated from Anopheles sinensis mosquitoes in Yunnan, China. Frontiers in Microbiology. 10, 1963 (1963).
- Ren, N., et al. Characterization of a novel reassortment Tibet orbivirus isolated from Culicoides spp. in Yunnan, PR China. Journal of General Virology. 102 (9), 001645 (2021).
