Isolement du virus associé aux moustiques à partir de moustiques collectés sur le terrain
Summary
De nombreuses nouvelles séquences pseudo-virales ont été trouvées chez les moustiques en raison de l’utilisation intensive des technologies de séquençage. Nous fournissons une procédure efficace pour isoler et amplifier les virus à l’aide de lignées cellulaires de vertébrés et de moustiques, qui pourrait servir de base à de futures études sur les virus associés aux moustiques, y compris les virus transmis par les moustiques et les virus spécifiques aux moustiques.
Abstract
Grâce à la vaste application des technologies de séquençage, de nombreuses nouvelles séquences virales ont été découvertes chez les arthropodes, y compris les moustiques. Les deux principales catégories de ces nouveaux virus associés aux moustiques sont les « virus transmis par les moustiques » et les « virus spécifiques aux moustiques (MSV) ». Ces nouveaux virus pourraient être pathogènes à la fois pour les vertébrés et les moustiques, ou ils pourraient simplement être symbiotiques avec les moustiques. Les virus d’entité sont essentiels pour confirmer les caractéristiques biologiques de ces virus. Ainsi, un protocole détaillé a été décrit ici pour l’isolement et l’amplification du virus à partir de moustiques collectés sur le terrain. Tout d’abord, les échantillons de moustiques ont été préparés en tant que surnageants d’homogénats de moustiques. Après une centrifugation à deux reprises, les surnageants ont ensuite été inoculés dans la lignée cellulaire de moustiques C6/36 ou la lignée cellulaire de vertébrés BHK-21 pour l’amplification du virus. Après 7 jours, les surnageants ont été collectés en tant que surnageants P1 et stockés à -80 °C. Ensuite, les surnageants P1 ont été passés deux fois de plus dans les cellules C6/36 ou BHK-21 pendant que l’état de la cellule était vérifié quotidiennement. Lorsque l’effet cytopathogène (ECP) sur les cellules a été découvert, ces surnageants ont été recueillis et utilisés pour identifier les virus. Ce protocole sert de base à la recherche future sur les virus associés aux moustiques, y compris les MBV et les MSV.
Introduction
Les moustiques sont un groupe d’arthropodes vecteurs pathogènes importants. Il existe environ 3 500 espèces de moustiques dans la famille Culicidae 1,2. Le développement de technologies de séquençage à haut débit a conduit à la découverte de nombreuses séquences nouvelles ressemblant à des virus chez des moustiques de différentes parties du monde3. En général, ces virus associés aux moustiques peuvent être classés en deux groupes principaux : les MBV et les MSV.
Les MBV sont un groupe de virus divers qui sont les agents responsables de nombreuses maladies humaines ou animales, telles que le virus de la fièvre jaune (YFV), le virus de la dengue (DENV), le virus de l’encéphalite japonaise (JEV), le virus du Nil occidental (WNV) et le virus de la fièvre de la vallée du Rift (RVFV)4. Ils ont gravement menacé la santé publique en provoquant une morbidité et une mortalité graves chez les humains et les animaux à travers le monde. Les MBV entretiennent naturellement un cycle de vie entre divers hôtes par transmission d’un moustique infecté à un hôte naïf, ainsi que d’un hôte infecté par le virus et à un moustique nourricier5. Par conséquent, ces virus peuvent infecter à la fois les lignées cellulaires de moustiques et les lignées cellulaires de vertébrés en laboratoire1.
Les VHS, qui comprennent le virus Yichang (YCN), le flavivirus Culex (CxFV) et le virus Chaoyang (CHAOV), sont un sous-groupe de virus spécifiques aux insectes 1,6,7. Au cours des dernières années, il y a eu une augmentation de la découverte de nouveaux VHS, et certains de ces VHS ont eu un impact sur la transmission des MBV. Par exemple, le CxFV, qui peut être une infection persistante chez Culex pipiens, pourrait supprimer la réplication du VNO à un stade précoce8. Un autre flavivirus spécifique à un insecte, le virus de l’agent de fusion cellulaire (CFAV), inhibe la propagation du DENV et du virus Zika (ZIKV) chez les moustiques Aedes aegypti 9. Ainsi, ce protocole est une approche utile pour isoler les virus associés aux moustiques et peut aider à poursuivre la recherche sur la distribution des agents pathogènes liés aux moustiques et le contrôle des maladies transmises par les moustiques.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’objectif de cette méthode était d’offrir un moyen pratique d’isoler les virus associés aux moustiques à l’aide de diverses lignées cellulaires. Il est essentiel d’ajouter l’antibiotique-antimycotique (pénicilline-streptomycine-amphotéricine) aux surnageants des homogénats de moustiques pour éviter la contamination par des bactéries ou des champignons. Les moustiques et les surnageants viraux obtenus sur le terrain doivent être réfrigérés à -80 °C pour éviter les cycles répétés de gel-dé…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par le projet de plan scientifique et technologique de Wuhan (2018201261638501).
Materials
| 0.22 µm membrane filter | Millipore | SLGP033RB | Polymer films with specific pore ratings.To remove cell debris and bacteria. |
| 24-well plates | CORNING | 3524 | Containers for cell |
| 75 cm2 flasks | CORNING | 430641 | Containers for cell |
| a sterile 2 mL tube with 3 mm ceramic beads | |||
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-062 | Antibiotic in the medium to prevent contamination from bacteria and fungi |
| Automated nucleic acid extraction system | NanoMagBio | S-48 | |
| BHK-21 cells | National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology | ||
| C6/36 cells | National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology | ||
| Centrifugal machine | Himac | CF16RN | Instrument for centrifugation of mosquito samples |
| CO2 | |||
| Dulbecco’s minimal essential medium (DMEM) | Gibco | C11995500BT | medium for vertebrate cell lines |
| Ebinur Lake virus | Cu20-XJ isolation | ||
| Feta Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10099141C | Provide nutrition for cells |
| high-speed low-temperature tissue homogenizer | servicebio | KZ-III-F | Instrument for grinding |
| incubator (28 °C) | Panasonic | MCO-18AC | Instrument for cell culture |
| incubator (37 °C) | Panasonic | MCO-18AC | Instrument for cell culture |
| PCR tube | |||
| penicillin-streptomycin | Gibco | 15410-122 | Antibiotic in the medium to prevent contamination from bacteria |
| Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B Solution | Gibco | 15240096 | |
| Refrigerator (-80 °C) | sanyo | MDF-U54V | |
| Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI) | Gibco | C11875500BT | medium for mosiquto cell lines |
| Screw cap storage tubes (2 mL) | biofil | FCT010005 | |
| sterile pestles | Tiangen | OSE-Y004 | Consumables for grinding |
| TGrinder OSE-Y30 electric tissue grinder | Tiangen | OSE-Y30 | Instrument for grinding |
| The dissecting microscope | ZEISS | stemi508 | |
| the light traps MXA-02 | Maxttrac | ||
| The mosquito absorbing machine | Ningbo Bangning | ||
| The pipette tips | Axygen | TF | |
| The QIAamp viral RNA mini kit | QIAGEN | 52906 | |
| Tweezers | Dumont | 0203-5-PO |
References
- Xia, H., Wang, Y., Atoni, E., Zhang, B., Yuan, Z. Mosquito-associated viruses in China. Virologica Sinica. 33 (1), 5-20 (2018).
- Atoni, E., et al. A dataset of distribution and diversity of mosquito-associated viruses and their mosquito vectors in China. Scientific Data. 7 (1), 342 (2020).
- Atoni, E., et al. The discovery and global distribution of novel mosquito-associated viruses in the last decade (2007-2017). Reviews in Medical Virology. 29 (6), 2079 (2019).
- Xia, H., et al. Comparative metagenomic profiling of viromes associated with four common mosquito species in China. Virologica Sinica. 33 (1), 59-66 (2018).
- Ong, O. T. W., Skinner, E. B., Johnson, B. J., Old, J. M. Mosquito-borne viruses and non-human vertebrates in Australia: A review. Viruses. 13 (2), 265 (2021).
- Agboli, E., Leggewie, M., Altinli, M., Schnettler, E. Mosquito-specific viruses-transmission and interaction. Viruses. 11 (9), 873 (2019).
- Halbach, R., Junglen, S., van Rij, R. P. Mosquito-specific and mosquito-borne viruses: evolution, infection, and host defense. Current Opinion in Insect Science. 22, 16-27 (2017).
- Bolling, B. G., Olea-Popelka, F. J., Eisen, L., Moore, C. G., Blair, C. D. Transmission dynamics of an insect-specific flavivirus in a naturally infected Culex pipiens laboratory colony and effects of co-infection on vector competence for West Nile virus. Virology. 427 (2), 90-97 (2012).
- Baidaliuk, A., et al. Cell-fusing agent virus reduces arbovirus dissemination in Aedes aegypti mosquitoes in vivo. Journal of Virology. 93 (18), 00715-00719 (2019).
- Atoni, E., et al. Metagenomic virome analysis of Culex mosquitoes from Kenya and China. Viruses. 10 (1), 30 (2018).
- Xia, H., et al. First isolation and characterization of a group C Banna virus (BAV) from Anopheles sinensis mosquitoes in Hubei, China. Viruses. 10 (10), 555 (2018).
- Shi, C., et al. Stability of the virome in lab- and field-collected Aedes albopictus mosquitoes across different developmental stages and possible core viruses in the publicly available virome data of Aedes mosquitoes. mSystems. 5 (5), 00640 (2020).
- Zhou, M., Chu, H. . Handbook for Classification and Identification of Main Vectors. , (2019).
- Wang, G., et al. Identifying the main mosquito species in China based on DNA barcoding. Plos One. 7 (10), (2012).
- Ratnasingham, S., Hebert, P. D. N. Bold: The Barcode of Life Data System (www.barcodinglife.org). Molecular Ecology Notes. 7 (3), 355-364 (2007).
- Huang, Y., et al. In vitro and in vivo characterization of a new strain of mosquito Flavivirus derived from Culicoides. Viruses. 14 (6), 1298 (2022).
- Zhao, L., et al. Characterization of a novel Tanay virus isolated from Anopheles sinensis mosquitoes in Yunnan, China. Frontiers in Microbiology. 10, 1963 (1963).
- Ren, N., et al. Characterization of a novel reassortment Tibet orbivirus isolated from Culicoides spp. in Yunnan, PR China. Journal of General Virology. 102 (9), 001645 (2021).
