Isolamento del virus associato alle zanzare dalle zanzare raccolte sul campo
Summary
Numerose nuove sequenze simili a virus sono state trovate nelle zanzare a causa dell’ampio uso di tecnologie di sequenziamento. Forniamo una procedura efficace per isolare e amplificare i virus utilizzando linee cellulari di vertebrati e zanzare, che potrebbero servire come base per studi futuri sui virus associati alle zanzare, compresi i virus trasmessi dalle zanzare e specifici per le zanzare.
Abstract
Con l’ampia applicazione delle tecnologie di sequenziamento, molte nuove sequenze simili a virus sono state scoperte negli artropodi, comprese le zanzare. Le due categorie principali di questi nuovi virus associati alle zanzare sono “virus trasmessi dalle zanzare (MBV)” e “virus specifici delle zanzare (MSV)”. Questi nuovi virus potrebbero essere patogeni sia per i vertebrati che per le zanzare, o potrebbero semplicemente essere simbiotici con le zanzare. I virus entità sono essenziali per confermare i caratteri biologici di questi virus. Pertanto, qui è stato descritto un protocollo dettagliato per l’isolamento e l’amplificazione del virus dalle zanzare raccolte sul campo. In primo luogo, i campioni di zanzara sono stati preparati come surnatanti di omogenati di zanzare. Dopo due centrifugazioni, i surnatanti sono stati poi inoculati nella linea cellulare di zanzara C6/36 o nella linea cellulare di vertebrati BHK-21 per l’amplificazione del virus. Dopo 7 giorni, i surnatanti sono stati raccolti come supernatanti P1 e conservati a -80 °C. Successivamente, i supernatanti P1 sono stati fatti passare altre due volte nelle cellule C6/36 o BHK-21 mentre lo stato della cellula veniva controllato quotidianamente. Quando è stato scoperto l’effetto citopatogeno (CPE) sulle cellule, questi surnatanti sono stati raccolti e utilizzati per identificare i virus. Questo protocollo serve come base per la ricerca futura sui virus associati alle zanzare, inclusi MBV e MSV.
Introduction
Le zanzare sono un gruppo di importanti vettori di artropodi patogeni. Ci sono circa 3.500 specie di zanzare nella famiglia Culicidae 1,2. Lo sviluppo di tecnologie di sequenziamento ad alto rendimento ha portato alla scoperta di molte nuove sequenze simili a virus nelle zanzare provenienti da diverse parti del mondo3. Generalmente, questi virus associati alle zanzare possono essere classificati in due gruppi principali: MBV e MSV.
Gli MBV sono un gruppo di virus diversi che sono agenti causali di molte malattie umane o animali, come il virus della febbre gialla (YFV), il virus della dengue (DENV), il virus dell’encefalite giapponese (JEV), il virus del Nilo occidentale (WNV) e il virus della febbre della Rift Valley (RVFV)4. Hanno seriamente minacciato la salute pubblica causando gravi morbilità e mortalità sia negli esseri umani che negli animali in tutto il mondo. Gli MBV sostengono naturalmente un ciclo di vita tra diversi ospiti attraverso la trasmissione da una zanzara infetta a un ospite ingenuo, nonché da un ospite infetto da virus e da una zanzara nutriente5. Pertanto, questi virus possono infettare sia le linee cellulari di zanzara che le linee cellulari di vertebrati nel laboratorio1.
Gli MSV, che includono il virus Yichang (YCN), il flavivirus Culex (CxFV) e il virus Chaoyang (CHAOV), sono un sottogruppo di virus specifici per insetti 1,6,7. Negli ultimi anni, c’è stato un aumento nella scoperta di nuovi MSV e alcuni di questi MSV hanno avuto un impatto sulla trasmissione di MBV. Ad esempio, CxFV, che può essere un’infezione persistente in Culex pipiens, potrebbe sopprimere la replicazione WNV in una fase iniziale8. Un altro flavivirus specifico per insetti, il virus dell’agente di fusione cellulare (CFAV), è stato trovato per inibire la propagazione del virus DENV e Zika (ZIKV) nelle zanzare Aedes aegypti 9. Pertanto, questo protocollo è un approccio utile per isolare i virus associati alle zanzare e può aiutare in ulteriori ricerche sulla distribuzione di agenti patogeni legati alle zanzare e sul controllo delle malattie trasmesse dalle zanzare.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’obiettivo di questo metodo era quello di offrire un modo pratico per isolare i virus associati alle zanzare utilizzando varie linee cellulari. È fondamentale aggiungere l’antibiotico-antimicotico (penicillina-streptomicina-amfotericina) ai surnatanti degli omogenati di zanzara per evitare la contaminazione da batteri o funghi. Le zanzare e i supernatanti virali ottenuti sul campo devono essere refrigerati a -80 °C per evitare ripetuti cicli di gelo-disgelo.
Un altro passo fondamentale nel …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dal Wuhan Science and Technology Plan Project (2018201261638501).
Materials
| 0.22 µm membrane filter | Millipore | SLGP033RB | Polymer films with specific pore ratings.To remove cell debris and bacteria. |
| 24-well plates | CORNING | 3524 | Containers for cell |
| 75 cm2 flasks | CORNING | 430641 | Containers for cell |
| a sterile 2 mL tube with 3 mm ceramic beads | |||
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-062 | Antibiotic in the medium to prevent contamination from bacteria and fungi |
| Automated nucleic acid extraction system | NanoMagBio | S-48 | |
| BHK-21 cells | National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology | ||
| C6/36 cells | National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology | ||
| Centrifugal machine | Himac | CF16RN | Instrument for centrifugation of mosquito samples |
| CO2 | |||
| Dulbecco’s minimal essential medium (DMEM) | Gibco | C11995500BT | medium for vertebrate cell lines |
| Ebinur Lake virus | Cu20-XJ isolation | ||
| Feta Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10099141C | Provide nutrition for cells |
| high-speed low-temperature tissue homogenizer | servicebio | KZ-III-F | Instrument for grinding |
| incubator (28 °C) | Panasonic | MCO-18AC | Instrument for cell culture |
| incubator (37 °C) | Panasonic | MCO-18AC | Instrument for cell culture |
| PCR tube | |||
| penicillin-streptomycin | Gibco | 15410-122 | Antibiotic in the medium to prevent contamination from bacteria |
| Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B Solution | Gibco | 15240096 | |
| Refrigerator (-80 °C) | sanyo | MDF-U54V | |
| Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI) | Gibco | C11875500BT | medium for mosiquto cell lines |
| Screw cap storage tubes (2 mL) | biofil | FCT010005 | |
| sterile pestles | Tiangen | OSE-Y004 | Consumables for grinding |
| TGrinder OSE-Y30 electric tissue grinder | Tiangen | OSE-Y30 | Instrument for grinding |
| The dissecting microscope | ZEISS | stemi508 | |
| the light traps MXA-02 | Maxttrac | ||
| The mosquito absorbing machine | Ningbo Bangning | ||
| The pipette tips | Axygen | TF | |
| The QIAamp viral RNA mini kit | QIAGEN | 52906 | |
| Tweezers | Dumont | 0203-5-PO |
References
- Xia, H., Wang, Y., Atoni, E., Zhang, B., Yuan, Z. Mosquito-associated viruses in China. Virologica Sinica. 33 (1), 5-20 (2018).
- Atoni, E., et al. A dataset of distribution and diversity of mosquito-associated viruses and their mosquito vectors in China. Scientific Data. 7 (1), 342 (2020).
- Atoni, E., et al. The discovery and global distribution of novel mosquito-associated viruses in the last decade (2007-2017). Reviews in Medical Virology. 29 (6), 2079 (2019).
- Xia, H., et al. Comparative metagenomic profiling of viromes associated with four common mosquito species in China. Virologica Sinica. 33 (1), 59-66 (2018).
- Ong, O. T. W., Skinner, E. B., Johnson, B. J., Old, J. M. Mosquito-borne viruses and non-human vertebrates in Australia: A review. Viruses. 13 (2), 265 (2021).
- Agboli, E., Leggewie, M., Altinli, M., Schnettler, E. Mosquito-specific viruses-transmission and interaction. Viruses. 11 (9), 873 (2019).
- Halbach, R., Junglen, S., van Rij, R. P. Mosquito-specific and mosquito-borne viruses: evolution, infection, and host defense. Current Opinion in Insect Science. 22, 16-27 (2017).
- Bolling, B. G., Olea-Popelka, F. J., Eisen, L., Moore, C. G., Blair, C. D. Transmission dynamics of an insect-specific flavivirus in a naturally infected Culex pipiens laboratory colony and effects of co-infection on vector competence for West Nile virus. Virology. 427 (2), 90-97 (2012).
- Baidaliuk, A., et al. Cell-fusing agent virus reduces arbovirus dissemination in Aedes aegypti mosquitoes in vivo. Journal of Virology. 93 (18), 00715-00719 (2019).
- Atoni, E., et al. Metagenomic virome analysis of Culex mosquitoes from Kenya and China. Viruses. 10 (1), 30 (2018).
- Xia, H., et al. First isolation and characterization of a group C Banna virus (BAV) from Anopheles sinensis mosquitoes in Hubei, China. Viruses. 10 (10), 555 (2018).
- Shi, C., et al. Stability of the virome in lab- and field-collected Aedes albopictus mosquitoes across different developmental stages and possible core viruses in the publicly available virome data of Aedes mosquitoes. mSystems. 5 (5), 00640 (2020).
- Zhou, M., Chu, H. . Handbook for Classification and Identification of Main Vectors. , (2019).
- Wang, G., et al. Identifying the main mosquito species in China based on DNA barcoding. Plos One. 7 (10), (2012).
- Ratnasingham, S., Hebert, P. D. N. Bold: The Barcode of Life Data System (www.barcodinglife.org). Molecular Ecology Notes. 7 (3), 355-364 (2007).
- Huang, Y., et al. In vitro and in vivo characterization of a new strain of mosquito Flavivirus derived from Culicoides. Viruses. 14 (6), 1298 (2022).
- Zhao, L., et al. Characterization of a novel Tanay virus isolated from Anopheles sinensis mosquitoes in Yunnan, China. Frontiers in Microbiology. 10, 1963 (1963).
- Ren, N., et al. Characterization of a novel reassortment Tibet orbivirus isolated from Culicoides spp. in Yunnan, PR China. Journal of General Virology. 102 (9), 001645 (2021).
