Isolamento de vírus associados a mosquitos coletados em campo
Summary
Numerosas novas sequências semelhantes a vírus foram encontradas em mosquitos devido ao uso extensivo de tecnologias de sequenciamento. Fornecemos um procedimento eficaz para isolar e amplificar vírus usando linhagens celulares de vertebrados e mosquitos, que pode servir de base para estudos futuros sobre vírus associados a mosquitos, incluindo vírus transmitidos por mosquitos e específicos por mosquitos.
Abstract
Com a ampla aplicação de tecnologias de sequenciamento, muitas novas sequências semelhantes a vírus foram descobertas em artrópodes, incluindo mosquitos. As duas principais categorias desses novos vírus associados a mosquitos são “vírus transmitidos por mosquitos (MBVs)” e “vírus específicos de mosquitos (MSVs)”. Esses novos vírus podem ser patogênicos para vertebrados e mosquitos, ou podem ser apenas simbióticos com mosquitos. Vírus de entidade são essenciais para confirmar os caracteres biológicos desses vírus. Assim, um protocolo detalhado foi descrito aqui para isolamento e amplificação de vírus a partir de mosquitos coletados em campo. Primeiramente, as amostras de mosquitos foram preparadas como sobrenadantes de homogeneizados de mosquitos. Após centrifugação duas vezes, os sobrenadantes foram inoculados na linhagem celular de mosquito C6/36 ou na linhagem celular de vertebrado BHK-21 para amplificação do vírus. Após 7 dias, os sobrenadantes foram coletados como sobrenadantes P1 e armazenados a -80 °C. Em seguida, os sobrenadantes P1 foram passados mais duas vezes em células C6/36 ou BHK-21 enquanto o status celular estava sendo verificado diariamente. Quando o efeito citopatogênico (CPE) sobre as células foi descoberto, esses sobrenadantes foram coletados e usados para identificar vírus. Este protocolo serve como base para pesquisas futuras sobre vírus associados a mosquitos, incluindo MBVs e MSVs.
Introduction
Os mosquitos são um grupo de importantes artrópodes vetores patogênicos. Existem aproximadamente 3.500 espécies de mosquitos na família Culicidae 1,2. O desenvolvimento de tecnologias de sequenciamento de alto rendimento levou à descoberta de muitas sequências novas semelhantes a vírus em mosquitos de diferentes partes do mundo3. Geralmente, esses vírus associados a mosquitos podem ser classificados em dois grupos principais: MBVs e MSVs.
Os MBVs são um grupo de diversos vírus que são agentes causadores de muitas doenças humanas ou animais, como o vírus da febre amarela (YFV), o vírus da dengue (DENV), o vírus da encefalite japonesa (JEV), o vírus do Nilo Ocidental (WNV) e o vírus da febre do Vale do Rift (RVFV)4. Eles têm ameaçado seriamente a saúde pública, causando morbidade e mortalidade graves em humanos e animais em todo o mundo. Os MBVs sustentam naturalmente um ciclo de vida entre diversos hospedeiros através da transmissão de um mosquito infectado para um hospedeiro ingênuo, bem como de um hospedeiro infectado por vírus e para um mosquito alimentador5. Portanto, esses vírus podem infectar tanto linhagens celulares de mosquitos quanto linhagens de células de vertebrados em laboratório1.
Os MSVs, que incluem os vírus Yichang (YCN), Culex flavivirus (CxFV) e Chaoyang virus (CHAOV), constituem um subgrupo de vírus insetos-específicos 1,6,7. Nos últimos anos, houve um aumento na descoberta de novos MSVs, e alguns desses MSVs foram encontrados para ter um impacto na transmissão de MBVs. Por exemplo, o CxFV, que pode ser uma infecção persistente em Culex pipiens, poderia suprimir a replicação do WNV em um estágio inicial8. Outro flavivírus específico de um inseto, o vírus do agente de fusão celular (CFAV), inibiu a propagação do DENV e do vírus Zika (ZIKV) em mosquitos Aedes aegypti 9. Assim, este protocolo é uma abordagem útil para o isolamento de vírus associados a mosquitos e pode ajudar em futuras pesquisas sobre a distribuição de patógenos relacionados a mosquitos e o controle de doenças transmitidas por mosquitos.
Protocol
Representative Results
Discussion
O objetivo deste método foi oferecer uma maneira prática de isolar vírus associados a mosquitos usando várias linhagens celulares. É fundamental adicionar o Antibiotico-Antimicótico (Penicilina-Estreptomicina-Anfotericina) aos sobrenadantes dos homogeneizados do mosquito para evitar a contaminação por bactérias ou fungos. Os mosquitos e sobrenadantes virais obtidos no campo devem ser refrigerados a -80 °C para evitar ciclos repetidos de congelamento-descongelamento.
Outro passo crít…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelo Wuhan Science and Technology Plan Project (2018201261638501).
Materials
| 0.22 µm membrane filter | Millipore | SLGP033RB | Polymer films with specific pore ratings.To remove cell debris and bacteria. |
| 24-well plates | CORNING | 3524 | Containers for cell |
| 75 cm2 flasks | CORNING | 430641 | Containers for cell |
| a sterile 2 mL tube with 3 mm ceramic beads | |||
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-062 | Antibiotic in the medium to prevent contamination from bacteria and fungi |
| Automated nucleic acid extraction system | NanoMagBio | S-48 | |
| BHK-21 cells | National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology | ||
| C6/36 cells | National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology | ||
| Centrifugal machine | Himac | CF16RN | Instrument for centrifugation of mosquito samples |
| CO2 | |||
| Dulbecco’s minimal essential medium (DMEM) | Gibco | C11995500BT | medium for vertebrate cell lines |
| Ebinur Lake virus | Cu20-XJ isolation | ||
| Feta Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10099141C | Provide nutrition for cells |
| high-speed low-temperature tissue homogenizer | servicebio | KZ-III-F | Instrument for grinding |
| incubator (28 °C) | Panasonic | MCO-18AC | Instrument for cell culture |
| incubator (37 °C) | Panasonic | MCO-18AC | Instrument for cell culture |
| PCR tube | |||
| penicillin-streptomycin | Gibco | 15410-122 | Antibiotic in the medium to prevent contamination from bacteria |
| Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B Solution | Gibco | 15240096 | |
| Refrigerator (-80 °C) | sanyo | MDF-U54V | |
| Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI) | Gibco | C11875500BT | medium for mosiquto cell lines |
| Screw cap storage tubes (2 mL) | biofil | FCT010005 | |
| sterile pestles | Tiangen | OSE-Y004 | Consumables for grinding |
| TGrinder OSE-Y30 electric tissue grinder | Tiangen | OSE-Y30 | Instrument for grinding |
| The dissecting microscope | ZEISS | stemi508 | |
| the light traps MXA-02 | Maxttrac | ||
| The mosquito absorbing machine | Ningbo Bangning | ||
| The pipette tips | Axygen | TF | |
| The QIAamp viral RNA mini kit | QIAGEN | 52906 | |
| Tweezers | Dumont | 0203-5-PO |
References
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