التقنيات الجزيئية والمناعية في نموذج فأر مهندس وراثيا لورم الجهاز الهضمي اللثوي
Summary
الهدف من هذه المخطوطة هو وصف نموذج الماوس KitV558Δ/+ وتقنيات التشريح والمعالجة الناجحة لعينات الماوس.
Abstract
الورم اللحمي المعدي المعوي (GIST) هو الساركوما البشرية الأكثر شيوعا وعادة ما يكون مدفوعا بطفرة واحدة في مستقبلات KIT. عبر أنواع الأورام ، تم تطوير العديد من نماذج الفئران من أجل التحقيق في الجيل التالي من علاجات السرطان. ومع ذلك ، في GIST ، تستخدم معظم الدراسات في الجسم الحي نماذج فأر xenograft التي لها قيود متأصلة. هنا ، نصف نموذجا للفأر المختص بالمناعة والمعدل وراثيا لورم لحمية الجهاز الهضمي يؤوي طفرة KitV558Δ / +. في هذا النموذج ، يتم دفع KIT المتحور ، وهو الجين الورمي المسؤول عن معظم GISTs ، بواسطة مروجه الداخلي مما يؤدي إلى GIST الذي يحاكي المظهر النسيجي والتسلل المناعي الذي شوهد في GISTs البشرية. علاوة على ذلك ، تم استخدام هذا النموذج بنجاح للتحقيق في كل من العلاجات الجزيئية والمناعية المستهدفة. هنا ، نصف تربية وصيانة مستعمرة الفأر KitV558Δ / +. بالإضافة إلى ذلك ، تفصل هذه الورقة علاج وشراء GIST ، وتصريف العقدة الليمفاوية المساريقية ، والأعور المجاور في الفئران KitV558Δ / + ، بالإضافة إلى إعداد العينات للتحليلات الجزيئية والمناعية.
Introduction
GIST هو الساركوما الأكثر شيوعا في البشر مع حدوث حوالي 6000 حالة في الولايات المتحدة الأمريكية1. يبدو أن GIST ينشأ من خلايا تنظيم ضربات القلب المعدية المعوية المسماة الخلايا الخلالية في Cajal ، وعادة ما يكون مدفوعا بطفرة واحدة في مجموعة التيروزين كيناز أو PDGFRA2. الجراحة هي الدعامة الأساسية لعلاج GIST ويمكن أن تكون علاجية ، ولكن يمكن علاج المرضى الذين يعانون من مرض متقدم باستخدام مثبط التيروزين كيناز (TKI) ، إيماتينيب. منذ تقديمه منذ أكثر من 20 عاما ، قام imatinib بتحويل نموذج العلاج في GIST ، مما أدى إلى تحسين البقاء على قيد الحياة في الأمراض المتقدمة من 1 إلى أكثر من 5 سنوات 3,4,5. لسوء الحظ ، نادرا ما يكون إيماتينيب علاجيا بسبب طفرات KIT المكتسبة ، لذلك هناك حاجة إلى علاجات جديدة لهذا الورم.
نماذج الفئران هي أداة بحثية مهمة في التحقيق في العلاجات الجديدة في السرطان. تم تطوير العديد من نماذج xenograft تحت الجلد و xenograft المشتقة من المريض والتحقيق فيها في GIST 6,7. ومع ذلك ، فإن الفئران التي تعاني من نقص المناعة لا تمثل GIST البشري بشكل كامل لأن GISTs تؤوي ملفات تعريف مناعية تفاضلية اعتمادا على طفرتها الورمية ، وتغيير البيئة الدقيقة لورم الجهاز الهضمي يحسن من آثار العلاج TKI 8,9. يحتوي الماوس Kit V558Δ/+ على حذف خط جرثومي غير متجانس في Kit exon 11 ، والذي يشفر مجال juxtamembrane ، وهو الموقع الأكثر تحورا شيوعا في GIST10 البشري. تقوم الفئرانV558Δ / + بتطوير GIST سيكال واحد مع اختراق 100٪ ، والأورام لها أنسجة مماثلة ، وإشارات جزيئية ، وتسلل مناعي ، واستجابة للعلاج مثل GIST البشري 8,11,12,13. هنا ، نصف تربية وعلاج وعزل العينات ومعالجتها في الفئران KitV558Δ / + لاستخدامها في البحوث الجزيئية والمناعية في GIST.
Protocol
Representative Results
Discussion
يعد نموذج الماوس KitV558Δ/+ أداة بحث قوية في التحليل الجزيئي والمناعي ل GIST. على الرغم من أن استراتيجية التربية تتطلب صليبا واحدا ، إلا أن استخدام مجموعات الفئران Kit V558Δ / + في التجارب التي تحلل استجابة الورم يتطلب تربية واسعة النطاق. يجب أن تكون الفئران متطابقة مع العمر وال?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم هندسة مجموعةV558Δ / + الفئران وراثيا ومشاركتها من قبل الدكتور بيتر بيسمر10. تم دعم هذا العمل من خلال منح المعاهد الوطنية للصحة R01 CA102613 و T32 CA251063.
Materials
| 100 micron filter | EMSCO | 1194-2360 | |
| 1x RBC lysis buffer | Life Technologies | 00-4333-57 | |
| 3mL syringe | Thermo Fisher Scientific/BD Biosciences | 14823435 | |
| 4–15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well, 30 µl | Bio-Rad | 4561083 | |
| 4% Paraformaldehyde Solution | Thermo Fisher Scientific | AAJ19943K2 | |
| 40 micron filter | EMSCO | 1194-2340 | |
| 5M NaCl | Sigma Aldrich | S6546 | |
| 70 micron filter | EMSCO | 1194-2350 | |
| AKT antibody (C67E7) | Cell Signaling | 4691 | |
| C57BL/6J mice | The Jackson Laboratory | ||
| Collagenase IV | Sigma Aldrich | C5138 | |
| Complete mini edta free protease inhibitor | Thomas Scientific | C852A34 | |
| Countess II Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | ||
| Disposable Scalpels | Thermo Fisher Scientific/Exel International | 14-840-00 | |
| Dnase I | Thomas Scientific | C756V81 | |
| Dog1 antibody | abcam | ab64085 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E9884 | |
| ERK antibody (p44/42) | Cell Signaling | 9102 | |
| FBS | Thomas Scientific | C788U23 | |
| FIJI software | FIJI | https://imagej.net/software/fiji | |
| Fisherbrand 850 Homogenizer | Thermo Fisher Scientific | 15-340-169 | |
| HBSS | University of Pennsylvania Cell Center | ||
| Imatinib mesylate | Selleck Chemicals | S1026 | |
| KIT antibody (D13A2) | Cell Signaling | 3074 | |
| KitV558Δ/+ Genotyping | Transnetyx | ||
| Microcentrifuge tubes (1.5mL) | Thermo Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Mouse on Mouse Immunodetection Kit, Basic | Vector Laboratories | BMK-2202 | |
| Nitrocellulose Membrane, Precut, 0.45 µm | Rio-Rad | 1620145 | |
| Nonfat Dry Milk | Thermo Fisher Scientific | NC9121673 | |
| Nonidet P 40 Substitute | Sigma Aldrich | 74385 | |
| p-AKT antibody (S473) | Cell Signaling | 4060 | |
| p-ERK antibody (p44/42) | Cell Signaling | 9101 | |
| p-KIT antibody (Y719) | Cell Signaling | 3391 | |
| PMSF Protease Inhibitor | Thermo Fisher Scientific | 36978 | |
| Proeinase K | Thermo Fisher Scientific | BP170050 | |
| Round-Bottom Polystyrene Test (FACS) Tubes | Falcon/Thermo Fisher Scientific | 14-959-2A | |
| RPMI | University of Pennsylvania Cell Center | ||
| Sodium fluoride (NaF) | Sigma Aldrich | 201154 | |
| Sodium orthovanadate (Na3VO4) | Sigma Aldrich | S6508 | |
| SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate | Thermo Fisher Scientific | 34076 | |
| TBS buffer (10x) | University of Pennsylvania Cell Center | ||
| Tissue culture dish (100mm2) | Thermo Fisher Scientific/Falcon | 08-772E | |
| TrisHCL | Thermo Fisher Scientific | BP1757500 | |
| Tween 20 | Rio-Rad | 1706531 | |
| vivaCT 80 platform | Scanco medical |
References
- Mastrangelo, G., et al. Incidence of soft tissue sarcoma and beyond: a population-based prospective study in 3 European regions. Cancer. 118 (21), 5339-5348 (2012).
- Joensuu, H., DeMatteo, R. P. The management of gastrointestinal stromal tumors: a model for targeted and multidisciplinary therapy of malignancy. Annual Review of Medicine. 63, 247-258 (2012).
- Blanke, C. D., et al. Long-term results from a randomized phase II trial of standard- versus higher-dose imatinib mesylate for patients with unresectable or metastatic gastrointestinal stromal tumors expressing KIT. Journal of Clinical Oncology. 26 (4), 620-625 (2008).
- Demetri, G. D., et al. Efficacy and safety of regorafenib for advanced gastrointestinal stromal tumours after failure of imatinib and sunitinib (GRID): an international, multicentre, randomised, placebo-controlled, phase 3 trial. Lancet. 381 (9863), 295-302 (2013).
- Gold, J. S. Outcome of metastatic GIST in the era before tyrosine kinase inhibitors. Annals of Surgical Oncology. 14 (1), 134-142 (2007).
- Huynh, H., et al. Sorafenib induces growth suppression in mouse models of gastrointestinal stromal tumor. Molecular Cancer Therapeutics. 8 (1), 152-159 (2009).
- Na, Y. S., et al. Establishment of patient-derived xenografts from patients with gastrointestinal stromal tumors: analysis of clinicopathological characteristics related to engraftment success. Scientific Reports. 10 (1), 7996 (2020).
- Balachandran, V. P., et al. Imatinib potentiates antitumor T cell responses in gastrointestinal stromal tumor through the inhibition of Ido. Nature Medicine. 17 (9), 1094-1100 (2011).
- Vitiello, G. A., et al. Differential immune profiles distinguish the mutational subtypes of gastrointestinal stromal tumor. Journal of Clinical Investigation. 129 (5), 1863-1877 (2019).
- Sommer, G., et al. Gastrointestinal stromal tumors in a mouse model by targeted mutation of the Kit receptor tyrosine kinase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (11), 6706-6711 (2003).
- Cavnar, M. J., et al. KIT oncogene inhibition drives intratumoral macrophage M2 polarization. Journal of Experimental Medicine. 210 (13), 2873-2886 (2013).
- Medina, B. D., et al. Oncogenic kinase inhibition limits Batf3-dependent dendritic cell development and antitumor immunity. Journal of Experimental Medicine. 216 (6), 1359-1376 (2019).
- Zhang, J. Q., et al. Macrophages and CD8(+) T cells mediate the antitumor efficacy of combined CD40 ligation and imatinib therapy in gastrointestinal stromal tumors. Cancer Immunology Research. 6 (4), 434-447 (2018).
- . General Protocol for Western Blotting Available from: https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Buttetin_6376.pdf (2022)
- Sadeghipour, A., Babaheidarian, P. Making formalin-fixed, paraffin embedded blocks. Biobanking: Methods and Protocols. , 253-268 (2019).
- Sy, J., Ang, L. -. C. Microtomy: Cutting formalin-fixed, paraffin-embedded sections. Biobanking: Methods and Protocols. , 269-278 (2019).
- Seifert, A. M., et al. PD-1/PD-L1 blockade enhances T-cell activity and antitumor efficacy of imatinib in gastrointestinal stromal tumors. Clinical Cancer Research. 23 (2), 454-465 (2017).
- Liu, M., et al. Oncogenic KIT modulates Type I IFN-mediated antitumor immunity in GIST. Cancer Immunology Research. 9 (5), 542-553 (2021).
- Rossi, F., et al. Oncogenic Kit signaling and therapeutic intervention in a mouse model of gastrointestinal stromal tumor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (34), 12843-12848 (2006).
