Molekylære og immunologiske teknikker i en genetisk manipuleret musemodel af gastrointestinal stromal tumor
Summary
Målet med dette manuskript er at beskrive KitV558Δ/+ musemodellen og teknikker til vellykket dissektion og behandling af museprøver.
Abstract
Gastrointestinal stromal tumor (GIST) er den mest almindelige humane sarkom og er typisk drevet af en enkelt mutation i KIT-receptoren. På tværs af tumortyper er der udviklet adskillige musemodeller for at undersøge den næste generation af kræftbehandlinger. I GIST bruger de fleste in vivo-undersøgelser imidlertid xenograft-musemodeller, der har iboende begrænsninger. Her beskriver vi en immunkompetent, genetisk manipuleret musemodel af gastrointestinal stromal tumor, der huser en KitV558Δ/+ mutation. I denne model drives mutant KIT, onkogenet, der er ansvarlig for de fleste GIST’er, af dets endogene promotor, hvilket fører til en GIST, der efterligner det histologiske udseende og immuninfiltration, der ses i humane GIST’er. Desuden er denne model blevet brugt med succes til at undersøge både målrettede molekylære og immunterapier. Her beskriver vi opdræt og vedligeholdelse af en KitV558Δ/+ musekoloni. Derudover beskriver dette papir behandling og indkøb af GIST, dræning af mesenterisk lymfeknude og tilstødende cecum i KitV558Δ /+ mus samt prøveforberedelse til molekylære og immunologiske analyser.
Introduction
GIST er det mest almindelige sarkom hos mennesker med en forekomst på ca. 6.000 tilfælde i USA1. GIST ser ud til at stamme fra de gastrointestinale pacemakerceller, der hedder de interstitielle celler i Cajal, og er typisk drevet af en enkelt mutation i tyrosinkinase KIT eller PDGFRA2. Kirurgi er grundpillen i behandling for GIST og kan være helbredende, men patienter med avanceret sygdom kan behandles med tyrosinkinasehæmmeren (TKI), imatinib. Siden introduktionen for over 20 år siden har imatinib transformeret behandlingsparadigmet i GIST og forbedret overlevelsen i avanceret sygdom fra 1 til over 5 år 3,4,5. Desværre er imatinib sjældent helbredende på grund af erhvervede KIT-mutationer, så der er behov for nye behandlinger for denne tumor.
Musemodeller er et vigtigt forskningsværktøj i undersøgelsen af nye terapier i kræft. Flere subkutane xenograft- og patientafledte xenograftmodeller er blevet udviklet og undersøgt i GIST 6,7. Immundefekte mus repræsenterer imidlertid ikke fuldt ud human GIST, da GIST’er har forskellige immunprofiler afhængigt af deres onkogene mutation, og ændring af det gastrointestinale tumormikromiljø forbedrer virkningerne af TKI-terapi 8,9. KitV558Δ/+ musen har en heterozygot kimlinje sletning i Kit exon 11, som koder for juxtamembrane domænet, det mest almindeligt muterede sted i human GIST10. KitV558Δ/+ mus udvikler en enkelt cecal GIST med 100% penetrans, og tumorer har lignende histologi, molekylær signalering, immuninfiltration og respons på terapi som human GIST 8,11,12,13. Her beskriver vi avl, behandling og prøveisolering og -behandling i KitV558Δ/+ mus til brug i molekylær og immunologisk forskning i GIST.
Protocol
Representative Results
Discussion
KitV558Δ/+ musemodellen er et kraftfuldt forskningsværktøj i den molekylære og immunologiske analyse af GIST. Selvom avlsstrategien kræver et enkelt kryds, kræver brug af KitV558Δ/+ musekohorter i eksperimenter, der analyserer tumorrespons, omfattende avl. Mus bør alders- og kønsmatches for at sikre lignende tumorvægte, og 10% af musene dør inden 8 ugers alderen, når tumorer er etableret. Mindre omfattende avlsstrategier er mulige, hvis man bruger avancerede billeddanne…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
KitV558Δ/+ mus blev genetisk manipuleret og delt af Dr. Peter Besmer10. Dette arbejde blev støttet af NIH-tilskud R01 CA102613 og T32 CA251063.
Materials
| 100 micron filter | EMSCO | 1194-2360 | |
| 1x RBC lysis buffer | Life Technologies | 00-4333-57 | |
| 3mL syringe | Thermo Fisher Scientific/BD Biosciences | 14823435 | |
| 4–15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well, 30 µl | Bio-Rad | 4561083 | |
| 4% Paraformaldehyde Solution | Thermo Fisher Scientific | AAJ19943K2 | |
| 40 micron filter | EMSCO | 1194-2340 | |
| 5M NaCl | Sigma Aldrich | S6546 | |
| 70 micron filter | EMSCO | 1194-2350 | |
| AKT antibody (C67E7) | Cell Signaling | 4691 | |
| C57BL/6J mice | The Jackson Laboratory | ||
| Collagenase IV | Sigma Aldrich | C5138 | |
| Complete mini edta free protease inhibitor | Thomas Scientific | C852A34 | |
| Countess II Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | ||
| Disposable Scalpels | Thermo Fisher Scientific/Exel International | 14-840-00 | |
| Dnase I | Thomas Scientific | C756V81 | |
| Dog1 antibody | abcam | ab64085 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E9884 | |
| ERK antibody (p44/42) | Cell Signaling | 9102 | |
| FBS | Thomas Scientific | C788U23 | |
| FIJI software | FIJI | https://imagej.net/software/fiji | |
| Fisherbrand 850 Homogenizer | Thermo Fisher Scientific | 15-340-169 | |
| HBSS | University of Pennsylvania Cell Center | ||
| Imatinib mesylate | Selleck Chemicals | S1026 | |
| KIT antibody (D13A2) | Cell Signaling | 3074 | |
| KitV558Δ/+ Genotyping | Transnetyx | ||
| Microcentrifuge tubes (1.5mL) | Thermo Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Mouse on Mouse Immunodetection Kit, Basic | Vector Laboratories | BMK-2202 | |
| Nitrocellulose Membrane, Precut, 0.45 µm | Rio-Rad | 1620145 | |
| Nonfat Dry Milk | Thermo Fisher Scientific | NC9121673 | |
| Nonidet P 40 Substitute | Sigma Aldrich | 74385 | |
| p-AKT antibody (S473) | Cell Signaling | 4060 | |
| p-ERK antibody (p44/42) | Cell Signaling | 9101 | |
| p-KIT antibody (Y719) | Cell Signaling | 3391 | |
| PMSF Protease Inhibitor | Thermo Fisher Scientific | 36978 | |
| Proeinase K | Thermo Fisher Scientific | BP170050 | |
| Round-Bottom Polystyrene Test (FACS) Tubes | Falcon/Thermo Fisher Scientific | 14-959-2A | |
| RPMI | University of Pennsylvania Cell Center | ||
| Sodium fluoride (NaF) | Sigma Aldrich | 201154 | |
| Sodium orthovanadate (Na3VO4) | Sigma Aldrich | S6508 | |
| SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate | Thermo Fisher Scientific | 34076 | |
| TBS buffer (10x) | University of Pennsylvania Cell Center | ||
| Tissue culture dish (100mm2) | Thermo Fisher Scientific/Falcon | 08-772E | |
| TrisHCL | Thermo Fisher Scientific | BP1757500 | |
| Tween 20 | Rio-Rad | 1706531 | |
| vivaCT 80 platform | Scanco medical |
References
- Mastrangelo, G., et al. Incidence of soft tissue sarcoma and beyond: a population-based prospective study in 3 European regions. Cancer. 118 (21), 5339-5348 (2012).
- Joensuu, H., DeMatteo, R. P. The management of gastrointestinal stromal tumors: a model for targeted and multidisciplinary therapy of malignancy. Annual Review of Medicine. 63, 247-258 (2012).
- Blanke, C. D., et al. Long-term results from a randomized phase II trial of standard- versus higher-dose imatinib mesylate for patients with unresectable or metastatic gastrointestinal stromal tumors expressing KIT. Journal of Clinical Oncology. 26 (4), 620-625 (2008).
- Demetri, G. D., et al. Efficacy and safety of regorafenib for advanced gastrointestinal stromal tumours after failure of imatinib and sunitinib (GRID): an international, multicentre, randomised, placebo-controlled, phase 3 trial. Lancet. 381 (9863), 295-302 (2013).
- Gold, J. S. Outcome of metastatic GIST in the era before tyrosine kinase inhibitors. Annals of Surgical Oncology. 14 (1), 134-142 (2007).
- Huynh, H., et al. Sorafenib induces growth suppression in mouse models of gastrointestinal stromal tumor. Molecular Cancer Therapeutics. 8 (1), 152-159 (2009).
- Na, Y. S., et al. Establishment of patient-derived xenografts from patients with gastrointestinal stromal tumors: analysis of clinicopathological characteristics related to engraftment success. Scientific Reports. 10 (1), 7996 (2020).
- Balachandran, V. P., et al. Imatinib potentiates antitumor T cell responses in gastrointestinal stromal tumor through the inhibition of Ido. Nature Medicine. 17 (9), 1094-1100 (2011).
- Vitiello, G. A., et al. Differential immune profiles distinguish the mutational subtypes of gastrointestinal stromal tumor. Journal of Clinical Investigation. 129 (5), 1863-1877 (2019).
- Sommer, G., et al. Gastrointestinal stromal tumors in a mouse model by targeted mutation of the Kit receptor tyrosine kinase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (11), 6706-6711 (2003).
- Cavnar, M. J., et al. KIT oncogene inhibition drives intratumoral macrophage M2 polarization. Journal of Experimental Medicine. 210 (13), 2873-2886 (2013).
- Medina, B. D., et al. Oncogenic kinase inhibition limits Batf3-dependent dendritic cell development and antitumor immunity. Journal of Experimental Medicine. 216 (6), 1359-1376 (2019).
- Zhang, J. Q., et al. Macrophages and CD8(+) T cells mediate the antitumor efficacy of combined CD40 ligation and imatinib therapy in gastrointestinal stromal tumors. Cancer Immunology Research. 6 (4), 434-447 (2018).
- . General Protocol for Western Blotting Available from: https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Buttetin_6376.pdf (2022)
- Sadeghipour, A., Babaheidarian, P. Making formalin-fixed, paraffin embedded blocks. Biobanking: Methods and Protocols. , 253-268 (2019).
- Sy, J., Ang, L. -. C. Microtomy: Cutting formalin-fixed, paraffin-embedded sections. Biobanking: Methods and Protocols. , 269-278 (2019).
- Seifert, A. M., et al. PD-1/PD-L1 blockade enhances T-cell activity and antitumor efficacy of imatinib in gastrointestinal stromal tumors. Clinical Cancer Research. 23 (2), 454-465 (2017).
- Liu, M., et al. Oncogenic KIT modulates Type I IFN-mediated antitumor immunity in GIST. Cancer Immunology Research. 9 (5), 542-553 (2021).
- Rossi, F., et al. Oncogenic Kit signaling and therapeutic intervention in a mouse model of gastrointestinal stromal tumor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (34), 12843-12848 (2006).
