Moleculaire en immunologische technieken in een genetisch gemanipuleerd muismodel van gastro-intestinale stromale tumor
Summary
Het doel van dit manuscript is om het KitV558Δ/+ muismodel en technieken voor succesvolle dissectie en verwerking van muismonsters te beschrijven.
Abstract
Gastro-intestinale stromale tumor (GIST) is het meest voorkomende menselijke sarcoom en wordt meestal aangedreven door een enkele mutatie in de KIT-receptor. Voor alle tumortypen zijn talloze muismodellen ontwikkeld om de volgende generatie kankertherapieën te onderzoeken. In GIST gebruiken de meeste in vivo studies echter xenograft muismodellen die inherente beperkingen hebben. Hier beschrijven we een immunocompetent, genetisch gemanipuleerd muismodel van gastro-intestinale stromale tumor met een KitV558Δ / + -mutatie. In dit model wordt mutant KIT, het oncogen dat verantwoordelijk is voor de meeste GISTs, aangedreven door zijn endogene promotor die leidt tot een GIST die het histologische uiterlijk en immuuninfiltraat nabootst dat wordt gezien in menselijke GISTs. Bovendien is dit model met succes gebruikt om zowel gerichte moleculaire als immuuntherapieën te onderzoeken. Hier beschrijven we het fokken en onderhouden van een KitV558Δ/+ muizenkolonie. Daarnaast beschrijft dit artikel de behandeling en verkrijging van GIST, drainerende mesenteriale lymfeklier en aangrenzende blindedarm in KitV558Δ / + -muizen, evenals monstervoorbereiding voor moleculaire en immunologische analyses.
Introduction
GIST is het meest voorkomende sarcoom bij mensen met een incidentie van ongeveer 6.000 gevallen in de Verenigde Staten van Amerika1. GIST lijkt afkomstig te zijn van de gastro-intestinale pacemakercellen die de interstitiële cellen van Cajal worden genoemd en wordt meestal aangedreven door een enkele mutatie in de tyrosinekinase KIT of PDGFRA2. Chirurgie is de steunpilaar van de behandeling voor GIST en kan curatief zijn, maar patiënten met een gevorderde ziekte kunnen worden behandeld met de tyrosinekinaseremmer (TKI), imatinib. Sinds de introductie meer dan 20 jaar geleden heeft imatinib het behandelingsparadigma in GIST getransformeerd, waardoor de overleving bij gevorderde ziekte is verbeterd van 1 naar meer dan 5 jaar 3,4,5. Helaas is imatinib zelden curatief vanwege verworven KIT-mutaties, dus nieuwe behandelingen zijn nodig voor deze tumor.
Muismodellen zijn een belangrijk onderzoeksinstrument bij het onderzoek naar nieuwe therapieën bij kanker. Meerdere subcutane xenograft- en patiënt-afgeleide xenograftmodellen zijn ontwikkeld en onderzocht in GIST 6,7. Immunodeficiënte muizen vertegenwoordigen echter niet volledig menselijke GIST, omdat GISTs differentiële immuunprofielen hebben, afhankelijk van hun oncogene mutatie, en het veranderen van de gastro-intestinale tumormicro-omgeving verbetert de effecten van TKI-therapie 8,9. De KitV558Δ/+ muis heeft een heterozygote kiembaandeletie in Kit exon 11, die codeert voor het juxtamembrane domein, de meest gemuteerde plaats in menselijke GIST10. KitV558Δ/+ muizen ontwikkelen een enkele cecale GIST met 100% penetrantie, en tumoren hebben vergelijkbare histologie, moleculaire signalering, immuuninfiltratie en respons op therapie als menselijke GIST 8,11,12,13. Hier beschrijven we het fokken, behandelen en isoleren en verwerken van monsters in KitV558Δ / + muizen voor gebruik in moleculair en immunologisch onderzoek in GIST.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het KitV558Δ/+ muismodel is een krachtig onderzoeksinstrument in de moleculaire en immunologische analyse van GIST. Hoewel de fokstrategie een enkele kruising vereist, vereist het gebruik van KitV558Δ / + muiscohorten in experimenten die de tumorrespons analyseren, uitgebreide fokkerij. Muizen moeten leeftijds- en geslachtsgematcht zijn om vergelijkbare tumorgewichten te garanderen, en 10% van de muizen sterft vóór de leeftijd van 8 weken wanneer tumoren worden vastgesteld. Min…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
KitV558Δ/+ muizen werden genetisch gemanipuleerd en gedeeld door Dr. Peter Besmer10. Dit werk werd ondersteund door NIH-subsidies R01 CA102613 en T32 CA251063.
Materials
| 100 micron filter | EMSCO | 1194-2360 | |
| 1x RBC lysis buffer | Life Technologies | 00-4333-57 | |
| 3mL syringe | Thermo Fisher Scientific/BD Biosciences | 14823435 | |
| 4–15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well, 30 µl | Bio-Rad | 4561083 | |
| 4% Paraformaldehyde Solution | Thermo Fisher Scientific | AAJ19943K2 | |
| 40 micron filter | EMSCO | 1194-2340 | |
| 5M NaCl | Sigma Aldrich | S6546 | |
| 70 micron filter | EMSCO | 1194-2350 | |
| AKT antibody (C67E7) | Cell Signaling | 4691 | |
| C57BL/6J mice | The Jackson Laboratory | ||
| Collagenase IV | Sigma Aldrich | C5138 | |
| Complete mini edta free protease inhibitor | Thomas Scientific | C852A34 | |
| Countess II Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | ||
| Disposable Scalpels | Thermo Fisher Scientific/Exel International | 14-840-00 | |
| Dnase I | Thomas Scientific | C756V81 | |
| Dog1 antibody | abcam | ab64085 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E9884 | |
| ERK antibody (p44/42) | Cell Signaling | 9102 | |
| FBS | Thomas Scientific | C788U23 | |
| FIJI software | FIJI | https://imagej.net/software/fiji | |
| Fisherbrand 850 Homogenizer | Thermo Fisher Scientific | 15-340-169 | |
| HBSS | University of Pennsylvania Cell Center | ||
| Imatinib mesylate | Selleck Chemicals | S1026 | |
| KIT antibody (D13A2) | Cell Signaling | 3074 | |
| KitV558Δ/+ Genotyping | Transnetyx | ||
| Microcentrifuge tubes (1.5mL) | Thermo Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Mouse on Mouse Immunodetection Kit, Basic | Vector Laboratories | BMK-2202 | |
| Nitrocellulose Membrane, Precut, 0.45 µm | Rio-Rad | 1620145 | |
| Nonfat Dry Milk | Thermo Fisher Scientific | NC9121673 | |
| Nonidet P 40 Substitute | Sigma Aldrich | 74385 | |
| p-AKT antibody (S473) | Cell Signaling | 4060 | |
| p-ERK antibody (p44/42) | Cell Signaling | 9101 | |
| p-KIT antibody (Y719) | Cell Signaling | 3391 | |
| PMSF Protease Inhibitor | Thermo Fisher Scientific | 36978 | |
| Proeinase K | Thermo Fisher Scientific | BP170050 | |
| Round-Bottom Polystyrene Test (FACS) Tubes | Falcon/Thermo Fisher Scientific | 14-959-2A | |
| RPMI | University of Pennsylvania Cell Center | ||
| Sodium fluoride (NaF) | Sigma Aldrich | 201154 | |
| Sodium orthovanadate (Na3VO4) | Sigma Aldrich | S6508 | |
| SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate | Thermo Fisher Scientific | 34076 | |
| TBS buffer (10x) | University of Pennsylvania Cell Center | ||
| Tissue culture dish (100mm2) | Thermo Fisher Scientific/Falcon | 08-772E | |
| TrisHCL | Thermo Fisher Scientific | BP1757500 | |
| Tween 20 | Rio-Rad | 1706531 | |
| vivaCT 80 platform | Scanco medical |
References
- Mastrangelo, G., et al. Incidence of soft tissue sarcoma and beyond: a population-based prospective study in 3 European regions. Cancer. 118 (21), 5339-5348 (2012).
- Joensuu, H., DeMatteo, R. P. The management of gastrointestinal stromal tumors: a model for targeted and multidisciplinary therapy of malignancy. Annual Review of Medicine. 63, 247-258 (2012).
- Blanke, C. D., et al. Long-term results from a randomized phase II trial of standard- versus higher-dose imatinib mesylate for patients with unresectable or metastatic gastrointestinal stromal tumors expressing KIT. Journal of Clinical Oncology. 26 (4), 620-625 (2008).
- Demetri, G. D., et al. Efficacy and safety of regorafenib for advanced gastrointestinal stromal tumours after failure of imatinib and sunitinib (GRID): an international, multicentre, randomised, placebo-controlled, phase 3 trial. Lancet. 381 (9863), 295-302 (2013).
- Gold, J. S. Outcome of metastatic GIST in the era before tyrosine kinase inhibitors. Annals of Surgical Oncology. 14 (1), 134-142 (2007).
- Huynh, H., et al. Sorafenib induces growth suppression in mouse models of gastrointestinal stromal tumor. Molecular Cancer Therapeutics. 8 (1), 152-159 (2009).
- Na, Y. S., et al. Establishment of patient-derived xenografts from patients with gastrointestinal stromal tumors: analysis of clinicopathological characteristics related to engraftment success. Scientific Reports. 10 (1), 7996 (2020).
- Balachandran, V. P., et al. Imatinib potentiates antitumor T cell responses in gastrointestinal stromal tumor through the inhibition of Ido. Nature Medicine. 17 (9), 1094-1100 (2011).
- Vitiello, G. A., et al. Differential immune profiles distinguish the mutational subtypes of gastrointestinal stromal tumor. Journal of Clinical Investigation. 129 (5), 1863-1877 (2019).
- Sommer, G., et al. Gastrointestinal stromal tumors in a mouse model by targeted mutation of the Kit receptor tyrosine kinase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (11), 6706-6711 (2003).
- Cavnar, M. J., et al. KIT oncogene inhibition drives intratumoral macrophage M2 polarization. Journal of Experimental Medicine. 210 (13), 2873-2886 (2013).
- Medina, B. D., et al. Oncogenic kinase inhibition limits Batf3-dependent dendritic cell development and antitumor immunity. Journal of Experimental Medicine. 216 (6), 1359-1376 (2019).
- Zhang, J. Q., et al. Macrophages and CD8(+) T cells mediate the antitumor efficacy of combined CD40 ligation and imatinib therapy in gastrointestinal stromal tumors. Cancer Immunology Research. 6 (4), 434-447 (2018).
- . General Protocol for Western Blotting Available from: https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Buttetin_6376.pdf (2022)
- Sadeghipour, A., Babaheidarian, P. Making formalin-fixed, paraffin embedded blocks. Biobanking: Methods and Protocols. , 253-268 (2019).
- Sy, J., Ang, L. -. C. Microtomy: Cutting formalin-fixed, paraffin-embedded sections. Biobanking: Methods and Protocols. , 269-278 (2019).
- Seifert, A. M., et al. PD-1/PD-L1 blockade enhances T-cell activity and antitumor efficacy of imatinib in gastrointestinal stromal tumors. Clinical Cancer Research. 23 (2), 454-465 (2017).
- Liu, M., et al. Oncogenic KIT modulates Type I IFN-mediated antitumor immunity in GIST. Cancer Immunology Research. 9 (5), 542-553 (2021).
- Rossi, F., et al. Oncogenic Kit signaling and therapeutic intervention in a mouse model of gastrointestinal stromal tumor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (34), 12843-12848 (2006).
