Molekulare und immunologische Techniken in einem gentechnisch veränderten Mausmodell des gastrointestinalen Stromatumors
Summary
Das Ziel dieses Manuskripts ist es, das KitV558Δ/+ Mausmodell und Techniken für die erfolgreiche Dissektion und Verarbeitung von Mausproben zu beschreiben.
Abstract
Der gastrointestinale Stromatumor (GIST) ist das häufigste menschliche Sarkom und wird typischerweise durch eine einzige Mutation im KIT-Rezeptor verursacht. Über alle Tumorarten hinweg wurden zahlreiche Mausmodelle entwickelt, um die nächste Generation von Krebstherapien zu untersuchen. In GIST verwenden die meisten In-vivo-Studien jedoch Xenograft-Mausmodelle, die inhärente Einschränkungen aufweisen. Hier beschreiben wir ein immunkompetentes, gentechnisch verändertes Mausmodell eines gastrointestinalen Stromatumors, der eine KitV558Δ/+ Mutation beherbergt. In diesem Modell wird das mutierte KIT, das für die meisten GISTs verantwortliche Onkogen, von seinem endogenen Promotor angetrieben, was zu einem GIST führt, der das histologische Erscheinungsbild und das Immuninfiltrat in menschlichen GISTs nachahmt. Darüber hinaus wurde dieses Modell erfolgreich eingesetzt, um sowohl gezielte molekulare als auch Immuntherapien zu untersuchen. Hier beschreiben wir die Zucht und Pflege einer KitV558Δ/+ Mauskolonie. Darüber hinaus beschreibt dieses Papier die Behandlung und Beschaffung von GIST, drainierendem mesenterialen Lymphknoten und angrenzendem Blinddarm in KitV558Δ / + -Mäusen sowie die Probenvorbereitung für molekulare und immunologische Analysen.
Introduction
GIST ist das häufigste Sarkom beim Menschen mit einer Inzidenz von etwa 6.000 Fällen in den Vereinigten Staaten von Amerika1. GIST scheint von den gastrointestinalen Schrittmacherzellen zu stammen, die als interstitielle Zellen von Cajal bezeichnet werden, und wird typischerweise durch eine einzige Mutation in der Tyrosinkinase KIT oder PDGFRA2 angetrieben. Chirurgie ist die Hauptstütze der Behandlung von GIST und kann kurativ sein, aber Patienten mit fortgeschrittener Erkrankung können mit dem Tyrosinkinase-Inhibitor (TKI), Imatinib, behandelt werden. Seit seiner Einführung vor über 20 Jahren hat Imatinib das Behandlungsparadigma in GIST verändert und das Überleben bei fortgeschrittenen Erkrankungen von 1 auf über 5 Jahreverbessert 3,4,5. Leider ist Imatinib aufgrund erworbener KIT-Mutationen selten kurativ, so dass neue Behandlungen für diesen Tumor erforderlich sind.
Mausmodelle sind ein wichtiges Forschungsinstrument bei der Erforschung neuartiger Therapien bei Krebserkrankungen. Mehrere subkutane Xenotransplantat- und patientenabgeleitete Xenograft-Modelle wurden in GIST 6,7 entwickelt und untersucht. Immundefiziente Mäuse repräsentieren jedoch nicht vollständig die menschliche GIST, da GISTs je nach onkogener Mutation unterschiedliche Immunprofile aufweisen und die Veränderung der gastrointestinalen Tumormikroumgebung die Wirkung der TKI-Therapie verbessert 8,9. Die Kit V558Δ/+ Maus hat eine heterozygote Keimbahndeletion in Kit Exon 11, die die Juxtamembrandomäne kodiert, die am häufigsten mutierte Stelle im menschlichen GIST10. KitV558Δ/+ Mäuse entwickeln ein einzelnes CECAL GIST mit 100% Penetranz, und Tumore haben eine ähnliche Histologie, molekulare Signalgebung, Immuninfiltration und Reaktion auf die Therapie wie menschliche GIST 8,11,12,13. Hier beschreiben wir die Züchtung, Behandlung und Probenisolierung und -verarbeitung in KitV558Δ/+-Mäusen für den Einsatz in der molekularen und immunologischen Forschung in GIST.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das Mausmodell KitV558Δ/+ ist ein leistungsfähiges Forschungswerkzeug in der molekularen und immunologischen Analyse von GIST. Obwohl die Züchtungsstrategie eine einzige Kreuzung erfordert, erfordert die Verwendung von KitV558Δ/+ Mauskohorten in Experimenten, die die Tumorreaktion analysieren, eine umfangreiche Zucht. Mäuse sollten alters- und geschlechtsgerecht sein, um ähnliche Tumorgewichte zu gewährleisten, und 10% der Mäuse sterben vor dem Alter von 8 Wochen, wenn Tumo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
KitV558Δ/+ Mäuse wurden gentechnisch verändert und von Dr. Peter Besmer10 geteilt. Diese Arbeit wurde durch die NIH-Zuschüsse R01 CA102613 und T32 CA251063 unterstützt.
Materials
| 100 micron filter | EMSCO | 1194-2360 | |
| 1x RBC lysis buffer | Life Technologies | 00-4333-57 | |
| 3mL syringe | Thermo Fisher Scientific/BD Biosciences | 14823435 | |
| 4–15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well, 30 µl | Bio-Rad | 4561083 | |
| 4% Paraformaldehyde Solution | Thermo Fisher Scientific | AAJ19943K2 | |
| 40 micron filter | EMSCO | 1194-2340 | |
| 5M NaCl | Sigma Aldrich | S6546 | |
| 70 micron filter | EMSCO | 1194-2350 | |
| AKT antibody (C67E7) | Cell Signaling | 4691 | |
| C57BL/6J mice | The Jackson Laboratory | ||
| Collagenase IV | Sigma Aldrich | C5138 | |
| Complete mini edta free protease inhibitor | Thomas Scientific | C852A34 | |
| Countess II Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | ||
| Disposable Scalpels | Thermo Fisher Scientific/Exel International | 14-840-00 | |
| Dnase I | Thomas Scientific | C756V81 | |
| Dog1 antibody | abcam | ab64085 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E9884 | |
| ERK antibody (p44/42) | Cell Signaling | 9102 | |
| FBS | Thomas Scientific | C788U23 | |
| FIJI software | FIJI | https://imagej.net/software/fiji | |
| Fisherbrand 850 Homogenizer | Thermo Fisher Scientific | 15-340-169 | |
| HBSS | University of Pennsylvania Cell Center | ||
| Imatinib mesylate | Selleck Chemicals | S1026 | |
| KIT antibody (D13A2) | Cell Signaling | 3074 | |
| KitV558Δ/+ Genotyping | Transnetyx | ||
| Microcentrifuge tubes (1.5mL) | Thermo Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Mouse on Mouse Immunodetection Kit, Basic | Vector Laboratories | BMK-2202 | |
| Nitrocellulose Membrane, Precut, 0.45 µm | Rio-Rad | 1620145 | |
| Nonfat Dry Milk | Thermo Fisher Scientific | NC9121673 | |
| Nonidet P 40 Substitute | Sigma Aldrich | 74385 | |
| p-AKT antibody (S473) | Cell Signaling | 4060 | |
| p-ERK antibody (p44/42) | Cell Signaling | 9101 | |
| p-KIT antibody (Y719) | Cell Signaling | 3391 | |
| PMSF Protease Inhibitor | Thermo Fisher Scientific | 36978 | |
| Proeinase K | Thermo Fisher Scientific | BP170050 | |
| Round-Bottom Polystyrene Test (FACS) Tubes | Falcon/Thermo Fisher Scientific | 14-959-2A | |
| RPMI | University of Pennsylvania Cell Center | ||
| Sodium fluoride (NaF) | Sigma Aldrich | 201154 | |
| Sodium orthovanadate (Na3VO4) | Sigma Aldrich | S6508 | |
| SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate | Thermo Fisher Scientific | 34076 | |
| TBS buffer (10x) | University of Pennsylvania Cell Center | ||
| Tissue culture dish (100mm2) | Thermo Fisher Scientific/Falcon | 08-772E | |
| TrisHCL | Thermo Fisher Scientific | BP1757500 | |
| Tween 20 | Rio-Rad | 1706531 | |
| vivaCT 80 platform | Scanco medical |
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