Técnicas moleculares e imunológicas em um modelo de rato geneticamente modificado de tumor estrommal gastrointestinal
Summary
O objetivo deste manuscrito é descrever o modelo de mouse KitV558Δ/+ e técnicas para dissecção e processamento bem-sucedidos de amostras de camundongos.
Abstract
O tumor estromal gastrointestinal (GIST) é o sarcoma humano mais comum e é tipicamente impulsionado por uma única mutação no receptor KIT. Entre os tipos de tumores, inúmeros modelos de camundongos foram desenvolvidos para investigar a próxima geração de terapias contra o câncer. No entanto, no GIST, a maioria dos estudos in vivo usa modelos de mouse xenoenxerto que têm limitações inerentes. Aqui, descrevemos um modelo de camundongos imunocompetente, geneticamente modificado, de tumor estromal gastrointestinal que abriga uma mutação KitV558Δ/+ Neste modelo, o KIT mutante, o oncogene responsável pela maioria dos GISTs, é impulsionado por seu promotor endógeno que leva a um GIST que imita a aparência histológica e o infiltrado imunológico visto em GISTs humanos. Além disso, este modelo tem sido usado com sucesso para investigar terapias moleculares e imunológicas direcionadas. Aqui, descrevemos a criação e manutenção de uma colônia de ratos KitV558Δ/+ Além disso, este artigo detalha o tratamento e a aquisição de GIST, drenando linfonodos mesentéricos e ceco adjacente em camundongos KitV558Δ/+ , bem como preparação de amostras para análises moleculares e imunológicas.
Introduction
GIST é o sarcoma mais comum em humanos com uma incidência de cerca de 6.000 casos nos Estados Unidos da América1. GIST parece se originar das células pacemaker gastrointestinal chamadas células intersticiais de Cajal, e é tipicamente impulsionado por uma única mutação no KIT de quinase tyrosina ou PDGFRA2. A cirurgia é o pilar do tratamento para GIST e pode ser curativa, mas pacientes com doença avançada podem ser tratados com o inibidor de tyrosina quinase (TKI), imatinib. Desde sua introdução, há mais de 20 anos, o imatinib transformou o paradigma do tratamento em GIST, melhorando a sobrevida em doenças avançadas de 1 para mais de 5 anos 3,4,5. Infelizmente, o imatinib raramente é curativo devido às mutações adquiridas do KIT, por isso novos tratamentos são necessários para este tumor.
Os modelos de camundongos são uma importante ferramenta de pesquisa na investigação de novas terapias em câncer. Múltiplos modelos de xenoenxerto subcutâneo e xenoenxerto derivados do paciente foram desenvolvidos e investigados em GIST 6,7. No entanto, camundongos imunodeficientes não representam totalmente o GIST humano, uma vez que os GISTs abrigam perfis imunológicos diferenciais dependendo de sua mutação oncogênica, e alterar o microambiente tumoral gastrointestinal melhora os efeitos da terapia TKI 8,9. O mouse KitV558Δ/+ tem uma exclusão germinal heterozigous em Kit exon 11, que codifica o domínio justxtamembrano, o local mais comumente mutado no GIST10 humano. Os camundongos KitV558Δ/+ desenvolvem um único cecal GIST com 100% de penetração, e os tumores têm histologia semelhante, sinalização molecular, infiltração imunológica e resposta à terapia como GIST 8,11,12,13. Aqui, descrevemos a reprodução, o tratamento e o isolamento e processamento de espécimes em camundongos KitV558Δ/+ para uso em pesquisas moleculares e imunológicas em GIST.
Protocol
Representative Results
Discussion
O modelo de mouse KitV558Δ/+ é uma poderosa ferramenta de pesquisa na análise molecular e imunológica do GIST. Embora a estratégia de reprodução exija uma única cruz, o uso de coortes de camundongos KitV558Δ/+ em experimentos que analisam a resposta ao tumor requer uma reprodução extensiva. Os camundongos devem ter idade e sexo compatível para garantir pesos tumorais semelhantes, e 10% dos camundongos morrem antes das 8 semanas de idade quando os tumores são estabeleci…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os camundongos KitV558Δ/+ foram geneticamente modificados e compartilhados pelo Dr. Peter Besmer10. Este trabalho foi apoiado pelas bolsas NIH R01 CA102613 e T32 CA251063.
Materials
| 100 micron filter | EMSCO | 1194-2360 | |
| 1x RBC lysis buffer | Life Technologies | 00-4333-57 | |
| 3mL syringe | Thermo Fisher Scientific/BD Biosciences | 14823435 | |
| 4–15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well, 30 µl | Bio-Rad | 4561083 | |
| 4% Paraformaldehyde Solution | Thermo Fisher Scientific | AAJ19943K2 | |
| 40 micron filter | EMSCO | 1194-2340 | |
| 5M NaCl | Sigma Aldrich | S6546 | |
| 70 micron filter | EMSCO | 1194-2350 | |
| AKT antibody (C67E7) | Cell Signaling | 4691 | |
| C57BL/6J mice | The Jackson Laboratory | ||
| Collagenase IV | Sigma Aldrich | C5138 | |
| Complete mini edta free protease inhibitor | Thomas Scientific | C852A34 | |
| Countess II Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | ||
| Disposable Scalpels | Thermo Fisher Scientific/Exel International | 14-840-00 | |
| Dnase I | Thomas Scientific | C756V81 | |
| Dog1 antibody | abcam | ab64085 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E9884 | |
| ERK antibody (p44/42) | Cell Signaling | 9102 | |
| FBS | Thomas Scientific | C788U23 | |
| FIJI software | FIJI | https://imagej.net/software/fiji | |
| Fisherbrand 850 Homogenizer | Thermo Fisher Scientific | 15-340-169 | |
| HBSS | University of Pennsylvania Cell Center | ||
| Imatinib mesylate | Selleck Chemicals | S1026 | |
| KIT antibody (D13A2) | Cell Signaling | 3074 | |
| KitV558Δ/+ Genotyping | Transnetyx | ||
| Microcentrifuge tubes (1.5mL) | Thermo Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Mouse on Mouse Immunodetection Kit, Basic | Vector Laboratories | BMK-2202 | |
| Nitrocellulose Membrane, Precut, 0.45 µm | Rio-Rad | 1620145 | |
| Nonfat Dry Milk | Thermo Fisher Scientific | NC9121673 | |
| Nonidet P 40 Substitute | Sigma Aldrich | 74385 | |
| p-AKT antibody (S473) | Cell Signaling | 4060 | |
| p-ERK antibody (p44/42) | Cell Signaling | 9101 | |
| p-KIT antibody (Y719) | Cell Signaling | 3391 | |
| PMSF Protease Inhibitor | Thermo Fisher Scientific | 36978 | |
| Proeinase K | Thermo Fisher Scientific | BP170050 | |
| Round-Bottom Polystyrene Test (FACS) Tubes | Falcon/Thermo Fisher Scientific | 14-959-2A | |
| RPMI | University of Pennsylvania Cell Center | ||
| Sodium fluoride (NaF) | Sigma Aldrich | 201154 | |
| Sodium orthovanadate (Na3VO4) | Sigma Aldrich | S6508 | |
| SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate | Thermo Fisher Scientific | 34076 | |
| TBS buffer (10x) | University of Pennsylvania Cell Center | ||
| Tissue culture dish (100mm2) | Thermo Fisher Scientific/Falcon | 08-772E | |
| TrisHCL | Thermo Fisher Scientific | BP1757500 | |
| Tween 20 | Rio-Rad | 1706531 | |
| vivaCT 80 platform | Scanco medical |
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