Молекулярные и иммунологические методы в генетически модифицированной мышиной модели стромальной опухоли желудочно-кишечного тракта
Summary
Целью данной рукописи является описание мышиной модели KitV558Δ/+ и методов успешного вскрытия и обработки образцов мышей.
Abstract
Стромальная опухоль желудочно-кишечного тракта (GIST) является наиболее распространенной саркомой человека и, как правило, обусловлена одной мутацией в рецепторе KIT. Для различных типов опухолей были разработаны многочисленные мышиные модели, чтобы исследовать следующее поколение методов лечения рака. Однако в GIST в большинстве исследований in vivo используются мышиные модели ксенотрансплантата, которые имеют присущие им ограничения. Здесь мы описываем иммунокомпетентную, генетически модифицированную мышиную модель стромальной опухоли желудочно-кишечного тракта, содержащую мутацию KitV558Δ/+ . В этой модели мутантный KIT, онкоген, ответственный за большинство ГИСТ, управляется его эндогенным промотором, приводящим к GIST, который имитирует гистологический вид и иммунный инфильтрат, наблюдаемый в ГИСТ человека. Кроме того, эта модель была успешно использована для исследования как целевой молекулярной, так и иммунной терапии. Здесь мы описываем разведение и содержание колонии мышей KitV558Δ/+ . Кроме того, в этой статье подробно описывается лечение и закупка GIST, дренирование брыжеечного лимфатического узла и прилегающей слепой кишки у мышей KitV558Δ/+ , а также подготовка образцов для молекулярного и иммунологического анализа.
Introduction
GIST является наиболее распространенной саркомой у людей с заболеваемостью около 6000 случаев в Соединенных Штатах Америки1. GIST, по-видимому, происходит из клеток желудочно-кишечного кардиостимулятора, называемых интерстициальными клетками Cajal, и обычно обусловлен одной мутацией в тирозинкиназе KIT или PDGFRA2. Хирургия является основой лечения GIST и может быть лечебной, но пациенты с прогрессирующим заболеванием могут лечиться ингибитором тирозинкиназы (TKI), иматинибом. С момента своего появления более 20 лет назад иматиниб трансформировал парадигму лечения в GIST, улучшив выживаемость при запущенном заболевании с 1 до более чем 5 лет 3,4,5. К сожалению, иматиниб редко излечивается из-за приобретенных мутаций KIT, поэтому для этой опухоли необходимы новые методы лечения.
Мышиные модели являются важным исследовательским инструментом в исследовании новых методов лечения рака. Несколько моделей подкожных ксенотрансплантатов и ксенотрансплантатов, полученных от пациента, были разработаны и исследованы в GIST 6,7. Тем не менее, иммунодефицитные мыши не в полной мере представляют GIST человека, поскольку GIST имеют дифференциальные иммунные профили в зависимости от их онкогенной мутации, а изменение микроокружения опухоли желудочно-кишечного тракта улучшает эффекты терапии TKI 8,9. Мышь KitV558Δ/+ имеет гетерозиготную делецию зародышевой линии в Kit exon 11, которая кодирует домен juxtamembrane, наиболее часто мутировавший сайт в человеческом GIST10. У мышей KitV558Δ/+ развивается один слепой GIST со 100% пенетранцией, а опухоли имеют аналогичную гистологию, молекулярную сигнализацию, иммунную инфильтрацию и ответ на терапию, как и человеческий GIST 8,11,12,13. Здесь мы описываем разведение, обработку, выделение и обработку образцов на мышах KitV558Δ/+ для использования в молекулярных и иммунологических исследованиях в GIST.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мышиная модель KitV558Δ/+ является мощным исследовательским инструментом в молекулярном и иммунологическом анализе GIST. Хотя стратегия разведения требует одного скрещивания, использование когорт мышей KitV558Δ/+ в экспериментах, анализирующих реакцию опухоли, требует о?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мыши KitV558Δ/+ были генетически модифицированы и совместно использовались доктором Питером Бесмером10. Эта работа была поддержана грантами NIH R01 CA102613 и T32 CA251063.
Materials
| 100 micron filter | EMSCO | 1194-2360 | |
| 1x RBC lysis buffer | Life Technologies | 00-4333-57 | |
| 3mL syringe | Thermo Fisher Scientific/BD Biosciences | 14823435 | |
| 4–15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well, 30 µl | Bio-Rad | 4561083 | |
| 4% Paraformaldehyde Solution | Thermo Fisher Scientific | AAJ19943K2 | |
| 40 micron filter | EMSCO | 1194-2340 | |
| 5M NaCl | Sigma Aldrich | S6546 | |
| 70 micron filter | EMSCO | 1194-2350 | |
| AKT antibody (C67E7) | Cell Signaling | 4691 | |
| C57BL/6J mice | The Jackson Laboratory | ||
| Collagenase IV | Sigma Aldrich | C5138 | |
| Complete mini edta free protease inhibitor | Thomas Scientific | C852A34 | |
| Countess II Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | ||
| Disposable Scalpels | Thermo Fisher Scientific/Exel International | 14-840-00 | |
| Dnase I | Thomas Scientific | C756V81 | |
| Dog1 antibody | abcam | ab64085 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E9884 | |
| ERK antibody (p44/42) | Cell Signaling | 9102 | |
| FBS | Thomas Scientific | C788U23 | |
| FIJI software | FIJI | https://imagej.net/software/fiji | |
| Fisherbrand 850 Homogenizer | Thermo Fisher Scientific | 15-340-169 | |
| HBSS | University of Pennsylvania Cell Center | ||
| Imatinib mesylate | Selleck Chemicals | S1026 | |
| KIT antibody (D13A2) | Cell Signaling | 3074 | |
| KitV558Δ/+ Genotyping | Transnetyx | ||
| Microcentrifuge tubes (1.5mL) | Thermo Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Mouse on Mouse Immunodetection Kit, Basic | Vector Laboratories | BMK-2202 | |
| Nitrocellulose Membrane, Precut, 0.45 µm | Rio-Rad | 1620145 | |
| Nonfat Dry Milk | Thermo Fisher Scientific | NC9121673 | |
| Nonidet P 40 Substitute | Sigma Aldrich | 74385 | |
| p-AKT antibody (S473) | Cell Signaling | 4060 | |
| p-ERK antibody (p44/42) | Cell Signaling | 9101 | |
| p-KIT antibody (Y719) | Cell Signaling | 3391 | |
| PMSF Protease Inhibitor | Thermo Fisher Scientific | 36978 | |
| Proeinase K | Thermo Fisher Scientific | BP170050 | |
| Round-Bottom Polystyrene Test (FACS) Tubes | Falcon/Thermo Fisher Scientific | 14-959-2A | |
| RPMI | University of Pennsylvania Cell Center | ||
| Sodium fluoride (NaF) | Sigma Aldrich | 201154 | |
| Sodium orthovanadate (Na3VO4) | Sigma Aldrich | S6508 | |
| SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate | Thermo Fisher Scientific | 34076 | |
| TBS buffer (10x) | University of Pennsylvania Cell Center | ||
| Tissue culture dish (100mm2) | Thermo Fisher Scientific/Falcon | 08-772E | |
| TrisHCL | Thermo Fisher Scientific | BP1757500 | |
| Tween 20 | Rio-Rad | 1706531 | |
| vivaCT 80 platform | Scanco medical |
References
- Mastrangelo, G., et al. Incidence of soft tissue sarcoma and beyond: a population-based prospective study in 3 European regions. Cancer. 118 (21), 5339-5348 (2012).
- Joensuu, H., DeMatteo, R. P. The management of gastrointestinal stromal tumors: a model for targeted and multidisciplinary therapy of malignancy. Annual Review of Medicine. 63, 247-258 (2012).
- Blanke, C. D., et al. Long-term results from a randomized phase II trial of standard- versus higher-dose imatinib mesylate for patients with unresectable or metastatic gastrointestinal stromal tumors expressing KIT. Journal of Clinical Oncology. 26 (4), 620-625 (2008).
- Demetri, G. D., et al. Efficacy and safety of regorafenib for advanced gastrointestinal stromal tumours after failure of imatinib and sunitinib (GRID): an international, multicentre, randomised, placebo-controlled, phase 3 trial. Lancet. 381 (9863), 295-302 (2013).
- Gold, J. S. Outcome of metastatic GIST in the era before tyrosine kinase inhibitors. Annals of Surgical Oncology. 14 (1), 134-142 (2007).
- Huynh, H., et al. Sorafenib induces growth suppression in mouse models of gastrointestinal stromal tumor. Molecular Cancer Therapeutics. 8 (1), 152-159 (2009).
- Na, Y. S., et al. Establishment of patient-derived xenografts from patients with gastrointestinal stromal tumors: analysis of clinicopathological characteristics related to engraftment success. Scientific Reports. 10 (1), 7996 (2020).
- Balachandran, V. P., et al. Imatinib potentiates antitumor T cell responses in gastrointestinal stromal tumor through the inhibition of Ido. Nature Medicine. 17 (9), 1094-1100 (2011).
- Vitiello, G. A., et al. Differential immune profiles distinguish the mutational subtypes of gastrointestinal stromal tumor. Journal of Clinical Investigation. 129 (5), 1863-1877 (2019).
- Sommer, G., et al. Gastrointestinal stromal tumors in a mouse model by targeted mutation of the Kit receptor tyrosine kinase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (11), 6706-6711 (2003).
- Cavnar, M. J., et al. KIT oncogene inhibition drives intratumoral macrophage M2 polarization. Journal of Experimental Medicine. 210 (13), 2873-2886 (2013).
- Medina, B. D., et al. Oncogenic kinase inhibition limits Batf3-dependent dendritic cell development and antitumor immunity. Journal of Experimental Medicine. 216 (6), 1359-1376 (2019).
- Zhang, J. Q., et al. Macrophages and CD8(+) T cells mediate the antitumor efficacy of combined CD40 ligation and imatinib therapy in gastrointestinal stromal tumors. Cancer Immunology Research. 6 (4), 434-447 (2018).
- . General Protocol for Western Blotting Available from: https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Buttetin_6376.pdf (2022)
- Sadeghipour, A., Babaheidarian, P. Making formalin-fixed, paraffin embedded blocks. Biobanking: Methods and Protocols. , 253-268 (2019).
- Sy, J., Ang, L. -. C. Microtomy: Cutting formalin-fixed, paraffin-embedded sections. Biobanking: Methods and Protocols. , 269-278 (2019).
- Seifert, A. M., et al. PD-1/PD-L1 blockade enhances T-cell activity and antitumor efficacy of imatinib in gastrointestinal stromal tumors. Clinical Cancer Research. 23 (2), 454-465 (2017).
- Liu, M., et al. Oncogenic KIT modulates Type I IFN-mediated antitumor immunity in GIST. Cancer Immunology Research. 9 (5), 542-553 (2021).
- Rossi, F., et al. Oncogenic Kit signaling and therapeutic intervention in a mouse model of gastrointestinal stromal tumor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (34), 12843-12848 (2006).
