Molekylära och immunologiska tekniker i en genetiskt konstruerad musmodell av gastrointestinal stromal tumör
Summary
Målet med detta manuskript är att beskriva KitV558Δ/+ musmodellen och tekniker för framgångsrik dissektion och bearbetning av musprover.
Abstract
Gastrointestinal stromal tumör (GIST) är den vanligaste humana sarkom och drivs vanligtvis av en enda mutation i KIT-receptorn. Över tumörtyper har många musmodeller utvecklats för att undersöka nästa generations cancerterapier. Men i GIST använder de flesta in vivo-studier xenograftmusmodeller som har inneboende begränsningar. Här beskriver vi en immunkompetent, genetiskt konstruerad musmodell av gastrointestinal stromal tumör som hyser en KitV558Δ/+ mutation. I denna modell drivs mutant KIT, onkogenen som är ansvarig för de flesta GIST, av sin endogena promotor som leder till en GIST som efterliknar det histologiska utseendet och immuninfiltrat som ses i mänskliga GIST. Dessutom har denna modell använts framgångsrikt för att undersöka både riktade molekylära och immunterapier. Här beskriver vi avel och underhåll av en KitV558Δ/+ muskoloni. Dessutom beskriver detta dokument behandling och upphandling av GIST, dränering av mesenterisk lymfkörtel och intilliggande cecum i KitV558Δ / + -möss, samt provberedning för molekylära och immunologiska analyser.
Introduction
GIST är den vanligaste sarkom hos människor med en förekomst av cirka 6 000 fall i USA1. GIST verkar härstamma från de gastrointestinala pacemakercellerna som heter de interstitiella cellerna i Cajal, och drivs vanligtvis av en enda mutation i tyrosinkinasen KIT eller PDGFRA2. Kirurgi är grundpelaren i behandlingen av GIST och kan vara botande, men patienter med avancerad sjukdom kan behandlas med tyrosinkinashämmaren (TKI), imatinib. Sedan introduktionen för över 20 år sedan har imatinib förändrat behandlingsparadigmet inom GIST och förbättrat överlevnaden vid avancerad sjukdom från 1 till över 5 år 3,4,5. Tyvärr är imatinib sällan botande på grund av förvärvade KIT-mutationer, så nya behandlingar behövs för denna tumör.
Musmodeller är ett viktigt forskningsverktyg i undersökningen av nya terapier vid cancer. Flera subkutana xenograft- och patientbaserade xenograftmodeller har utvecklats och undersökts i GIST 6,7. Immunbristmöss representerar emellertid inte helt human GIST eftersom GIST har differentiella immunprofiler beroende på deras onkogena mutation, och förändring av den gastrointestinala tumörmikromiljön förbättrar effekterna av TKI-terapi 8,9. KitV558Δ /+ -musen har en heterozygot bakterieradering i Kit exon 11, som kodar för juxtamembrandomänen, den vanligaste muterade platsen i mänsklig GIST10. KitV558Δ / + möss utvecklar en enda cecal GIST med 100% penetrans, och tumörer har liknande histologi, molekylär signalering, immuninfiltration och svar på terapi som human GIST 8,11,12,13. Här beskriver vi avel, behandling och provisolering och bearbetning i KitV558Δ /+ möss för användning i molekylär och immunologisk forskning inom GIST.
Protocol
Representative Results
Discussion
KitV558Δ/+ musmodellen är ett kraftfullt forskningsverktyg inom molekylär och immunologisk analys av GIST. Även om avelsstrategin kräver ett enda kors, kräver användning av KitV558Δ / + muskohorter i experiment som analyserar tumörrespons omfattande avel. Möss bör ålders- och könsmatchas för att säkerställa liknande tumörvikter, och 10% av mössen dör före 8 veckors ålder när tumörer etableras. Mindre omfattande avelsstrategier är möjliga om man använder av…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
KitV558Δ /+ möss var genetiskt konstruerade och delades av Dr. Peter Besmer10. Detta arbete stöddes av NIH-bidrag R01 CA102613 och T32 CA251063.
Materials
| 100 micron filter | EMSCO | 1194-2360 | |
| 1x RBC lysis buffer | Life Technologies | 00-4333-57 | |
| 3mL syringe | Thermo Fisher Scientific/BD Biosciences | 14823435 | |
| 4–15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well, 30 µl | Bio-Rad | 4561083 | |
| 4% Paraformaldehyde Solution | Thermo Fisher Scientific | AAJ19943K2 | |
| 40 micron filter | EMSCO | 1194-2340 | |
| 5M NaCl | Sigma Aldrich | S6546 | |
| 70 micron filter | EMSCO | 1194-2350 | |
| AKT antibody (C67E7) | Cell Signaling | 4691 | |
| C57BL/6J mice | The Jackson Laboratory | ||
| Collagenase IV | Sigma Aldrich | C5138 | |
| Complete mini edta free protease inhibitor | Thomas Scientific | C852A34 | |
| Countess II Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | ||
| Disposable Scalpels | Thermo Fisher Scientific/Exel International | 14-840-00 | |
| Dnase I | Thomas Scientific | C756V81 | |
| Dog1 antibody | abcam | ab64085 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E9884 | |
| ERK antibody (p44/42) | Cell Signaling | 9102 | |
| FBS | Thomas Scientific | C788U23 | |
| FIJI software | FIJI | https://imagej.net/software/fiji | |
| Fisherbrand 850 Homogenizer | Thermo Fisher Scientific | 15-340-169 | |
| HBSS | University of Pennsylvania Cell Center | ||
| Imatinib mesylate | Selleck Chemicals | S1026 | |
| KIT antibody (D13A2) | Cell Signaling | 3074 | |
| KitV558Δ/+ Genotyping | Transnetyx | ||
| Microcentrifuge tubes (1.5mL) | Thermo Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Mouse on Mouse Immunodetection Kit, Basic | Vector Laboratories | BMK-2202 | |
| Nitrocellulose Membrane, Precut, 0.45 µm | Rio-Rad | 1620145 | |
| Nonfat Dry Milk | Thermo Fisher Scientific | NC9121673 | |
| Nonidet P 40 Substitute | Sigma Aldrich | 74385 | |
| p-AKT antibody (S473) | Cell Signaling | 4060 | |
| p-ERK antibody (p44/42) | Cell Signaling | 9101 | |
| p-KIT antibody (Y719) | Cell Signaling | 3391 | |
| PMSF Protease Inhibitor | Thermo Fisher Scientific | 36978 | |
| Proeinase K | Thermo Fisher Scientific | BP170050 | |
| Round-Bottom Polystyrene Test (FACS) Tubes | Falcon/Thermo Fisher Scientific | 14-959-2A | |
| RPMI | University of Pennsylvania Cell Center | ||
| Sodium fluoride (NaF) | Sigma Aldrich | 201154 | |
| Sodium orthovanadate (Na3VO4) | Sigma Aldrich | S6508 | |
| SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate | Thermo Fisher Scientific | 34076 | |
| TBS buffer (10x) | University of Pennsylvania Cell Center | ||
| Tissue culture dish (100mm2) | Thermo Fisher Scientific/Falcon | 08-772E | |
| TrisHCL | Thermo Fisher Scientific | BP1757500 | |
| Tween 20 | Rio-Rad | 1706531 | |
| vivaCT 80 platform | Scanco medical |
References
- Mastrangelo, G., et al. Incidence of soft tissue sarcoma and beyond: a population-based prospective study in 3 European regions. Cancer. 118 (21), 5339-5348 (2012).
- Joensuu, H., DeMatteo, R. P. The management of gastrointestinal stromal tumors: a model for targeted and multidisciplinary therapy of malignancy. Annual Review of Medicine. 63, 247-258 (2012).
- Blanke, C. D., et al. Long-term results from a randomized phase II trial of standard- versus higher-dose imatinib mesylate for patients with unresectable or metastatic gastrointestinal stromal tumors expressing KIT. Journal of Clinical Oncology. 26 (4), 620-625 (2008).
- Demetri, G. D., et al. Efficacy and safety of regorafenib for advanced gastrointestinal stromal tumours after failure of imatinib and sunitinib (GRID): an international, multicentre, randomised, placebo-controlled, phase 3 trial. Lancet. 381 (9863), 295-302 (2013).
- Gold, J. S. Outcome of metastatic GIST in the era before tyrosine kinase inhibitors. Annals of Surgical Oncology. 14 (1), 134-142 (2007).
- Huynh, H., et al. Sorafenib induces growth suppression in mouse models of gastrointestinal stromal tumor. Molecular Cancer Therapeutics. 8 (1), 152-159 (2009).
- Na, Y. S., et al. Establishment of patient-derived xenografts from patients with gastrointestinal stromal tumors: analysis of clinicopathological characteristics related to engraftment success. Scientific Reports. 10 (1), 7996 (2020).
- Balachandran, V. P., et al. Imatinib potentiates antitumor T cell responses in gastrointestinal stromal tumor through the inhibition of Ido. Nature Medicine. 17 (9), 1094-1100 (2011).
- Vitiello, G. A., et al. Differential immune profiles distinguish the mutational subtypes of gastrointestinal stromal tumor. Journal of Clinical Investigation. 129 (5), 1863-1877 (2019).
- Sommer, G., et al. Gastrointestinal stromal tumors in a mouse model by targeted mutation of the Kit receptor tyrosine kinase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (11), 6706-6711 (2003).
- Cavnar, M. J., et al. KIT oncogene inhibition drives intratumoral macrophage M2 polarization. Journal of Experimental Medicine. 210 (13), 2873-2886 (2013).
- Medina, B. D., et al. Oncogenic kinase inhibition limits Batf3-dependent dendritic cell development and antitumor immunity. Journal of Experimental Medicine. 216 (6), 1359-1376 (2019).
- Zhang, J. Q., et al. Macrophages and CD8(+) T cells mediate the antitumor efficacy of combined CD40 ligation and imatinib therapy in gastrointestinal stromal tumors. Cancer Immunology Research. 6 (4), 434-447 (2018).
- . General Protocol for Western Blotting Available from: https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Buttetin_6376.pdf (2022)
- Sadeghipour, A., Babaheidarian, P. Making formalin-fixed, paraffin embedded blocks. Biobanking: Methods and Protocols. , 253-268 (2019).
- Sy, J., Ang, L. -. C. Microtomy: Cutting formalin-fixed, paraffin-embedded sections. Biobanking: Methods and Protocols. , 269-278 (2019).
- Seifert, A. M., et al. PD-1/PD-L1 blockade enhances T-cell activity and antitumor efficacy of imatinib in gastrointestinal stromal tumors. Clinical Cancer Research. 23 (2), 454-465 (2017).
- Liu, M., et al. Oncogenic KIT modulates Type I IFN-mediated antitumor immunity in GIST. Cancer Immunology Research. 9 (5), 542-553 (2021).
- Rossi, F., et al. Oncogenic Kit signaling and therapeutic intervention in a mouse model of gastrointestinal stromal tumor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (34), 12843-12848 (2006).
