离体 小鼠尿路上皮细胞腺病毒-Cre介导的基因缺失的类器官模型
Summary
该协议描述了小鼠尿路上皮类器官的产生和表征过程，这些类器官在感兴趣的基因中具有缺失。这些方法包括收获小鼠尿路上皮细胞，用腺病毒用CMV启动子驱动Cre表达的 离体 转导，以及 体外 和 体内 表征。
Abstract
膀胱癌是一个研究不足的领域，特别是在基因工程小鼠模型（GEMMs）中。具有组织特异性Cre和loxP位点的自交GEMM一直是条件或诱导基因靶向的黄金标准。为了提供更快，更有效的实验模型，使用腺病毒Cre和携带肿瘤抑制因子Trp53，Pten和Rb1的多个loxP等位基因的正常尿路上皮细胞开发了离体类器官培养系统。正常的尿路上皮细胞与三重 floxed 小鼠的四个膀胱酶解脱（Trp53f / f：Ptenf / f：Rb1f / f）。尿路上皮细胞通过CMV启动子（Ad5CMVCre）驱动的腺病毒-Cre进行体外转导。将转导的膀胱类器官在体外和体内进行培养、繁殖和表征。PCR 用于确认 Trp53、Pten 和 Rb1 中的基因缺失。类器官的免疫荧光 （IF） 染色显示尿路上皮谱系标志物（CK5 和 p63）的阳性表达。将类器官皮下注射到宿主小鼠中以进行肿瘤扩张和连续传代。异种移植物的免疫组化（IHC）表现出CK7，CK5和p63的阳性表达以及CK8和Uroplakin 3的阴性表达。总之，腺病毒介导的基因从具有loxP位点工程化的小鼠尿路上皮细胞中缺失是快速测试已定义遗传改变的致瘤潜力的有效方法。
Introduction
膀胱癌是男性中第四大常见癌症，每年在美国影响超过80，000人1。三十多年来，基于铂金的化疗一直是晚期膀胱癌患者的标准护理。最近美国食品和药物管理局（FDA）批准了免疫疗法（抗PD-1和抗PD-L1免疫检查点抑制剂），厄达非替尼（一种成纤维细胞生长因子受体抑制剂）和enfortumab vedotin（一种抗体 – 药物偶联物）2，3，4，2，4，从而彻底改变了膀胱癌治疗的前景。然而，没有临床批准的生物标志物可用于预测对化疗或免疫治疗的反应。迫切需要生成信息丰富的临床前模型，以提高对驱动膀胱癌进展的机制的理解，并为不同的治疗方式开发预测性生物标志物。
膀胱转化研究的一个主要障碍是缺乏临床前模型来概括人类膀胱癌的发病机制和治疗反应5，6。已经开发了多种临床前模型，包括 体外 2D模型（细胞系或有条件重编程细胞）， 体外 3D模型（类器官，3D打印）和 体内 模型（异种移植物，致癌物诱导，基因工程模型和患者来源的异种移植物）2，6。基因工程小鼠模型（GEMMs）可用于膀胱癌生物学中的许多应用，包括肿瘤表型分析，候选基因和/或信号通路的机制研究以及治疗反应的临床前评估6，7。GEMM可以利用位点特异性重组酶（Cre-loxP）来控制一个或多个肿瘤抑制基因中的遗传缺失。生成具有多个基因缺失的所需GEMM的过程非常耗时，费力且昂贵5.该方法的总体目标是开发一种快速有效的 离体 Cre递送方法，用于从携带三重 floxed 等位基因（Trp53，Pten 和 Rb1）的正常小鼠尿路上皮细胞建立膀胱三重敲除（TKO）模型8。 离体 方法的主要优点是快速的工作流程（1-2周而不是多年的小鼠育种）。本文描述了在免疫功能正常的C57 BL / 6J小鼠中收获具有浮选等位基因的正常尿路上皮细胞， 离体 腺病毒转导，类器官培养以及 体外 和 体内 表征的方案。该方法可进一步用于在含有任何絮状等位基因组合的免疫功能小鼠中产生临床相关的膀胱癌类器官。
Protocol
Representative Results
Discussion
GEMM一直是从正常细胞开始的癌症建模的黄金标准，允许对潜在的致癌扰动（癌基因激活和/或肿瘤抑制因子的丢失）的后果进行严格测试。在这里，提供了一种快速有效的方案，通过对正常小鼠尿路上皮细胞进行 离体 基因编辑来生成膀胱癌类器官，这些细胞携带感兴趣的基因中的浮出等位基因。H&E和IHC染色表明，TKO类器官表现出与高级尿路上皮尿路上皮一致的组织学，具有鳞状分化和基底…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项研究工作得到了NIH Grants，K08CA252161（Q.L.），R01CA234162和R01 CA207757（D.W.G.），P30CA016056（NCI癌症中心核心支持补助金），罗斯威尔公园联盟基金会和泌尿科之友基金会的部分支持。我们感谢玛丽莎·布拉斯克和米拉·帕霍莫娃对手稿的校对。
Materials
| 100 μm sterile cell strainer | Corning | 431752 | |
| 1 mL syringe | BD | 309659 | |
| 25G 1.5 inches needle | EXELINT International | 26406 | |
| Adenovirus (Ad5CMVCre High Titer, 1E11 pfu/ml) | UI Viral Vector Core | VVC-U of Iowa-5-HT | |
| C57 BL/6J | Jackson Lab | 000664 | |
| Charcoal-stripped FBS | Gibco | A3382101 | |
| Collagenase/hyaluronidase | Stemcell Technologies | 07912 | |
| Dispase | Stemcell Technologies | 07913 | |
| DPBS, 1x | Corning | 21-031-CV | |
| L-glutamine substitute (GlutaMAX) | Gibco | 35-050-061 | |
| Mammary Epithelial Cell Growth medium | Lonza | CC-3150 | |
| Matrix extracts from Engelbreth–Holm–Swarm mouse sarcomas (Matrigel) | Corning | CB-40234 | |
| Monoclonal mouse anti-CK20 | DAKO | M7019 | IF 1:100 |
| Monoclonal mouse anti-CK7 | Santa Cruz Biotechnology | SC-23876 | IHC 1:50 |
| Monoclonal mouse anti-p63 | Abcam | ab735 | IHC 1:100, IF 1:50 |
| Monoclonal mouse anti-Upk3 | Fitzgerald | 10R-U103A | IHC 1:50 |
| Monoclonal mouse anti-Vimentin | Santa Cruz Biotechnology | SC-6260 | IF 1:100 |
| Monoclonal rat anti-CK8 | Developmental Studies Hybridoma Bank | TROMA-I-s | IF 1:100 |
| HERAcell vios 160i CO2 incubator | Thermo Fisher | 51033557 | |
| Polyclonal chicken anti-CK5 | Biolegend | 905901 | IF 1:500 |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | |
| Recombinant enzyme of trypsin substitute (TrypLE Express Enzyme) | Thermo Fisher | 12605036 | |
| Signature benchtop shaking incubator Model 1575 | VWR | 35962-091 | |
| Specimen Processing Gel (HistoGel) | Thermo Fisher | HG-4000-012 | |
| Surgical blade size 10 | Integra Miltex | 4-110 | |
| Sorvall T1 centrifuge | Thermo Fisher | 75002383 | |
| Y-27632 | Selleckchem | S1049 |
References
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