السابقين فيفو النموذج العضوي لحذف الجينات بوساطة الفيروس الغدي-Cre في خلايا الفأر البولية
Summary
يصف هذا البروتوكول عملية توليد وتوصيف المواد العضوية البولية الفئران التي تؤوي عمليات حذف في الجينات ذات الاهتمام. وتشمل الطرق حصاد الخلايا البولية الثيلية للفئران ، والنقل خارج الجسم الحي مع الفيروس الغدي الذي يقود تعبير Cre مع مروج CMV ، وفي المختبر وكذلك في توصيف الجسم الحي .
Abstract
سرطان المثانة هو مجال غير مدروس ، خاصة في نماذج الفئران المهندسة وراثيا (GEMMs). كانت GEMMs المولودة مع مواقع Cre و loxP الخاصة بالأنسجة هي المعايير الذهبية لاستهداف الجينات المشروطة أو المستحثة. لتوفير نماذج تجريبية أسرع وأكثر كفاءة ، تم تطوير نظام زراعة عضوي خارج الجسم الحي باستخدام الفيروس الغدي Cre والخلايا البولية الطبيعية التي تحمل أليلات loxP متعددة من مثبطات الورم Trp53 و Pten و Rb1. يتم فصل الخلايا البولية الطبيعية إنزيميا عن أربع مثانات من الفئران الثلاثية المفلطحة (Trp53 f/f: Pten f/f: Rb1 f/f). يتم نقل الخلايا البولية خارج الجسم الحي مع الفيروس الغدي-Cre مدفوعا بمروج CMV (Ad5CMVCre). يتم استزراع عضويات المثانة المحولة ونشرها وتمييزها في المختبر وفي الجسم الحي. يستخدم PCR لتأكيد حذف الجينات في Trp53 و Pten و Rb1. يوضح تلطيخ التألق المناعي (IF) للعضويات تعبيرا إيجابيا عن علامات النسب البولي (CK5 و p63). يتم حقن المواد العضوية تحت الجلد في الفئران المضيفة لتوسيع الورم والممرات التسلسلية. تظهر الكيمياء النسيجية المناعية (IHC) ل xenografts تعبيرا إيجابيا عن CK7 و CK5 و p63 وتعبيرا سلبيا عن CK8 و Uroplakin 3. باختصار ، يعد حذف الجينات بوساطة الفيروس الغدي من الخلايا البولية اللولبية للفئران المصممة بمواقع loxP طريقة فعالة لاختبار الإمكانات السرطانية للتغيرات الجينية المحددة بسرعة.
Introduction
سرطان المثانة هو رابع أكثر أنواع السرطان شيوعا لدى الرجال ويصيب أكثر من 80000 شخص سنويا في الولايات المتحدة1. كان العلاج الكيميائي القائم على البلاتين هو معيار الرعاية للمرضى الذين يعانون من سرطان المثانة المتقدم لأكثر من ثلاثة عقود. لقد تم إحداث ثورة في مشهد علاج سرطان المثانة من خلال الموافقة الأخيرة لإدارة الغذاء والدواء (FDA) على العلاج المناعي (مثبطات نقاط التفتيش المناعية المضادة ل PD-1 و PD-L1) ، و erdafitinib (مثبط مستقبلات عامل نمو الخلايا الليفية) و enfortumab vedotin (اقتران الأجسام المضادة والأدوية) 2،3،4. ومع ذلك، لا تتوفر مؤشرات حيوية معتمدة سريريا للتنبؤ بالاستجابات للعلاج الكيميائي أو العلاج المناعي. هناك حاجة ماسة إلى إنشاء نماذج ما قبل السريرية غنية بالمعلومات يمكنها تحسين فهم الآليات التي تدفع تطور سرطان المثانة وتطوير مؤشرات حيوية تنبؤية لطرق العلاج المختلفة.
تتمثل إحدى العقبات الرئيسية في الأبحاث الانتقالية للمثانة في عدم وجود نماذج ما قبل السريرية تلخص التسبب في سرطان المثانة البشري واستجابات العلاج 5,6. تم تطوير نماذج متعددة قبل السريرية ، بما في ذلك نماذج 2D في المختبر (خطوط الخلايا أو الخلايا المعاد برمجتها بشكل مشروط) ، في نماذج 3D المختبرية (المواد العضوية ، الطباعة ثلاثية الأبعاد) ، وفي نماذج الجسم الحي (xenograft ، النماذج المستحثة بالمواد المسرطنة ، المهندسة وراثيا ، و xenograft المشتقة من المريض) 2,6. تعد نماذج الفئران المهندسة وراثيا (GEMMs) مفيدة للعديد من التطبيقات في بيولوجيا سرطان المثانة ، بما في ذلك تحليلات الأنماط الظاهرية للورم ، والتحقيقات الميكانيكية للجينات المرشحة و / أو مسارات الإشارات ، والتقييم قبل السريري للاستجابات العلاجية 6,7. يمكن ل GEMMs استخدام المؤتلفات الخاصة بالموقع (Cre-loxP) للتحكم في الحذف الجيني في واحد أو أكثر من الجينات المثبطة للورم. عملية توليد GEMMs المطلوبة مع حذف الجينات المتعددة تستغرق وقتا طويلا وشاقة ومكلفة5. الهدف العام من هذه الطريقة هو تطوير طريقة سريعة وفعالة لتسليم Cre خارج الجسم الحي لإنشاء نماذج خروج المغلوب الثلاثي للمثانة (TKO) من الخلايا البولية العادية للفأر التي تحمل أليلات ثلاثية مفعول (Trp53 و Pten و Rb1)8. الميزة الرئيسية لطريقة ex vivo هي سير العمل السريع (1-2 أسابيع بدلا من سنوات من تربية الماوس). توضح هذه المقالة بروتوكول حصاد الخلايا البولية الطبيعية مع الأليلات المفلطحة، ونقل الفيروس الغدي خارج الجسم الحي، والثقافات العضوية، والتوصيف في المختبر وفي الجسم الحي في الفئران C57 BL/6J المناعية. يمكن استخدام هذه الطريقة بشكل أكبر لتوليد عضويات سرطان المثانة ذات الصلة سريريا في الفئران ذات الكفاءة المناعية التي تؤوي أي مزيج من الأليلات المفلطحة.
Protocol
Representative Results
Discussion
كانت GEMMs هي المعايير الذهبية لنمذجة السرطان التي بدأت من الخلايا الطبيعية ، مما يسمح باختبار عواقب الاضطرابات السرطانية المحتملة (تنشيط الجينات الورمية و / أو فقدان مثبطات الورم) بدقة. هنا ، يتم توفير بروتوكول سريع وفعال لتوليد عضويات سرطان المثانة عن طريق تحرير الجينات خارج الجسم الحي</…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل البحثي جزئيا من قبل NIH Grants و K08CA252161 (Q.L.) و R01CA234162 و R01 CA207757 (D.W.G.) و P30CA016056 (منحة الدعم الأساسية لمركز NCI للسرطان) ومؤسسة روزويل بارك ألاينس ومؤسسة أصدقاء المسالك البولية. نشكر ماريسا بلاسك وميلا باكهوموفا على التدقيق اللغوي للمخطوطة.
Materials
| 100 μm sterile cell strainer | Corning | 431752 | |
| 1 mL syringe | BD | 309659 | |
| 25G 1.5 inches needle | EXELINT International | 26406 | |
| Adenovirus (Ad5CMVCre High Titer, 1E11 pfu/ml) | UI Viral Vector Core | VVC-U of Iowa-5-HT | |
| C57 BL/6J | Jackson Lab | 000664 | |
| Charcoal-stripped FBS | Gibco | A3382101 | |
| Collagenase/hyaluronidase | Stemcell Technologies | 07912 | |
| Dispase | Stemcell Technologies | 07913 | |
| DPBS, 1x | Corning | 21-031-CV | |
| L-glutamine substitute (GlutaMAX) | Gibco | 35-050-061 | |
| Mammary Epithelial Cell Growth medium | Lonza | CC-3150 | |
| Matrix extracts from Engelbreth–Holm–Swarm mouse sarcomas (Matrigel) | Corning | CB-40234 | |
| Monoclonal mouse anti-CK20 | DAKO | M7019 | IF 1:100 |
| Monoclonal mouse anti-CK7 | Santa Cruz Biotechnology | SC-23876 | IHC 1:50 |
| Monoclonal mouse anti-p63 | Abcam | ab735 | IHC 1:100, IF 1:50 |
| Monoclonal mouse anti-Upk3 | Fitzgerald | 10R-U103A | IHC 1:50 |
| Monoclonal mouse anti-Vimentin | Santa Cruz Biotechnology | SC-6260 | IF 1:100 |
| Monoclonal rat anti-CK8 | Developmental Studies Hybridoma Bank | TROMA-I-s | IF 1:100 |
| HERAcell vios 160i CO2 incubator | Thermo Fisher | 51033557 | |
| Polyclonal chicken anti-CK5 | Biolegend | 905901 | IF 1:500 |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | |
| Recombinant enzyme of trypsin substitute (TrypLE Express Enzyme) | Thermo Fisher | 12605036 | |
| Signature benchtop shaking incubator Model 1575 | VWR | 35962-091 | |
| Specimen Processing Gel (HistoGel) | Thermo Fisher | HG-4000-012 | |
| Surgical blade size 10 | Integra Miltex | 4-110 | |
| Sorvall T1 centrifuge | Thermo Fisher | 75002383 | |
| Y-27632 | Selleckchem | S1049 |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Fuchs, H. E., Jemal, A. Cancer statistics, 2021. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 71 (1), 7-33 (2021).
- Zhu, S., et al. Preclinical models for bladder cancer research. Hematology/Oncology Clinics of North America. 35 (3), 613-632 (2021).
- DeGraff, D. J., et al. Current preclinical models for the advancement of translational bladder cancer research. Molecular Cancer Therapeutics. 12 (2), 121-130 (2013).
- Andreev-Drakhlin, A. Y., et al. The evolving treatment landscape of advanced urothelial carcinoma. Current Opinion in Oncology. 33 (3), 221-230 (2021).
- Mullenders, J., et al. Mouse and human urothelial cancer organoids: A tool for bladder cancer research. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (10), 4567-4574 (2019).
- Kobayashi, T., Owczarek, T. B., McKiernan, J. M., Abate-Shen, C. Modelling bladder cancer in mice: opportunities and challenges. Nature Reviews. Cancer. 15 (1), 42-54 (2015).
- Kersten, K., de Visser, K. E., van Miltenburg, M. H., Jonkers, J. Genetically engineered mouse models in oncology research and cancer medicine. EMBO Molecular Medicine. 9 (2), 137-153 (2017).
- Ku, S. Y., et al. Rb1 and Trp53 cooperate to suppress prostate cancer lineage plasticity, metastasis, and antiandrogen resistance. Science. 355 (6320), 78-83 (2017).
- Lee, S. H., et al. Tumor evolution and drug response in patient-derived organoid models of bladder cancer. Cell. 173 (2), 515-528 (2018).
- Fujii, E., et al. A simple method for histopathological evaluation of organoids. Journal of Toxicologic Pathology. 31 (1), 81-85 (2018).
- Georgas, K. M., et al. An illustrated anatomical ontology of the developing mouse lower urogenital tract. Development. 142 (10), 1893-1908 (2015).
- Santos, C. P., et al. Urothelial organoids originating from Cd49f(high) mouse stem cells display Notch-dependent differentiation capacity. Nature Communication. 10 (1), 4407 (2019).
- Wang, L., et al. A genetically defined disease model reveals that urothelial cells can initiate divergent bladder cancer phenotypes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (1), 563-572 (2020).
- Yang, D., et al. Intertumoral heterogeneity in SCLC is influenced by the cell type of origin. Cancer Discovery. 8 (10), 1316-1331 (2018).
- Sutherland, K. D., et al. Cell of origin of small cell lung cancer: inactivation of Trp53 and Rb1 in distinct cell types of adult mouse lung. Cancer Cell. 19 (6), 754-764 (2011).
- Bottger, F., et al. Tumor heterogeneity underlies differential cisplatin sensitivity in mouse models of small-cell lung cancer. Cell Reports. 27 (11), 3345-3358 (2019).
- Puzio-Kuter, A. M., et al. Inactivation of p53 and Pten promotes invasive bladder cancer. Genes & Development. 23 (6), 675-680 (2009).
- Park, S., et al. Novel mouse models of bladder cancer identify a prognostic signature associated with risk of disease progression. 암 연구학. 81 (20), 5161-5175 (2021).
- Hawley, S. P., Wills, M. K., Jones, N. Adenovirus-mediated genetic removal of signaling molecules in cultured primary mouse embryonic fibroblasts. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (43), e2160 (2010).
- Feng, W., et al. Rapid interrogation of cancer cell of origin through CRISPR editing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (32), 2110344118 (2021).
