एक्स वीवो माउस यूरोथेलियल कोशिकाओं में एडेनोवायरस-क्रे मध्यस्थता जीन विलोपन का ऑर्गेनोइड मॉडल
Summary
यह प्रोटोकॉल ब्याज के जीन में विलोपन को परेशान करने वाले माउस यूरोथेलियल ऑर्गेनोइड्स की पीढ़ी और लक्षण वर्णन की प्रक्रिया का वर्णन करता है। विधियों में माउस यूरोथेलियल कोशिकाओं की कटाई, सीएमवी प्रमोटर के साथ क्रे अभिव्यक्ति ड्राइविंग एडेनोवायरस के साथ पूर्व विवो ट्रांसडक्शन, और इन विट्रो के साथ-साथ विवो लक्षण वर्णन में भी शामिल है।
Abstract
मूत्राशय का कैंसर एक अध्ययन क्षेत्र है, विशेष रूप से आनुवंशिक रूप से इंजीनियर माउस मॉडल (जीईएमएम) में। ऊतक-विशिष्ट क्रे और लोक्सपी साइटों के साथ अंतर्जात जीईएमएम सशर्त या इंड्यूसिबल जीन लक्ष्यीकरण के लिए सोने के मानक रहे हैं। तेजी से और अधिक कुशल प्रयोगात्मक मॉडल प्रदान करने के लिए, एक पूर्व विवो ऑर्गेनॉइड संस्कृति प्रणाली एडेनोवायरस क्रे और सामान्य यूरोथेलियल कोशिकाओं का उपयोग करके विकसित की जाती है जो ट्यूमर सप्रेसर्स टीआरपी 53, पीटीएन और आरबी 1 के कई लॉक्सपी एलील्स को ले जाती है। सामान्य यूरोथेलियल कोशिकाओं को एंजाइमेटिक रूप से ट्रिपल फ्लोक्स्ड चूहों (टीआरपी 53 एफ / एफ: पीटीएनएफ / एफ: आरबी 1एफ / एफ) के चार मूत्राशय से अलग किया जाता है। यूरोथेलियल कोशिकाओं को सीएमवी प्रमोटर (एडी 5 सीएमवीसीआरई) द्वारा संचालित एडेनोवायरस-क्रे के साथ पूर्व विवो को ट्रांसड्यूस किया जाता है। ट्रांसड्यूड मूत्राशय ऑर्गेनोइड्स को सुसंस्कृत, प्रचारित और इन विट्रो और विवो में विशेषता है। पीसीआर का उपयोग टीआरपी 53, पीटीएन और आरबी 1 में जीन विलोपन की पुष्टि करने के लिए किया जाता है। “ऑर्गेनोइड्स के इम्यूनोफ्लोरेसेंस (आईएफ) धुंधला होना यूरोथेलियल वंश मार्करों (सीके 5 और पी 63) की सकारात्मक अभिव्यक्ति को दर्शाता है”. ऑर्गेनोइड्स को ट्यूमर विस्तार और धारावाहिक मार्ग के लिए मेजबान चूहों में चमड़े के नीचे इंजेक्ट किया जाता है। विद्वेष की इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (आईएचसी) सीके 7, सीके 5, और पी 63 की सकारात्मक अभिव्यक्ति और सीके 8 और यूरोप्लाकिन 3 की नकारात्मक अभिव्यक्ति प्रदर्शित करती है। संक्षेप में, लोक्सपी साइटों के साथ इंजीनियर माउस यूरोथेलियल कोशिकाओं से एडेनोवायरस-मध्यस्थता जीन विलोपन परिभाषित आनुवंशिक परिवर्तनों की ट्यूमरजेनिक क्षमता का तेजी से परीक्षण करने के लिए एक कुशल तरीका है।
Introduction
मूत्राशय का कैंसर पुरुषों में चौथा सबसे आम कैंसर है और संयुक्त राज्य अमेरिका में सालाना 80,000 से अधिक लोगों को प्रभावित करताहै। प्लैटिनम-आधारित कीमोथेरेपी तीन दशकों से अधिक समय से उन्नत मूत्राशय के कैंसर वाले रोगियों के लिए देखभाल का मानक रहा है। मूत्राशय के कैंसर के उपचार के परिदृश्य को इम्यूनोथेरेपी (एंटी-पीडी -1 और एंटी-पीडी-एल 1 प्रतिरक्षा चेकपॉइंट इनहिबिटर), एर्डाफिटिनिब (एक फाइब्रोब्लास्ट ग्रोथ फैक्टर रिसेप्टर इनहिबिटर) और एनफोर्टुमैब वेडोटिन (एक एंटीबॉडी-ड्रग कंजुगेट) 2,3,4 के हालिया खाद्य और औषधि प्रशासन (एफडीए) अनुमोदन द्वारा क्रांतिकारी बनाया गया है। हालांकि, कीमोथेरेपी या इम्यूनोथेरेपी की प्रतिक्रियाओं की भविष्यवाणी के लिए कोई नैदानिक रूप से अनुमोदित बायोमार्कर उपलब्ध नहीं हैं। सूचनात्मक प्रीक्लिनिकल मॉडल उत्पन्न करने की एक महत्वपूर्ण आवश्यकता है जो मूत्राशय के कैंसर की प्रगति को चलाने वाले तंत्र की समझ में सुधार कर सकते हैं और विभिन्न उपचार पद्धतियों के लिए भविष्य कहनेवाला बायोमार्कर विकसित कर सकते हैं।
मूत्राशय ट्रांसलेशनल अनुसंधान में एक बड़ी बाधा प्रीक्लिनिकल मॉडल की कमी है जो मानव मूत्राशय के कैंसर रोगजनन और उपचार प्रतिक्रियाओं 5,6 को दोहराती है। इन विट्रो 2 डी मॉडल (सेल लाइनों या सशर्त रूप से पुन: प्रोग्राम की गई कोशिकाओं), इन विट्रो 3 डी मॉडल (ऑर्गेनोइड्स, 3 डी प्रिंटिंग) और विवो मॉडल (विद्वेष, कार्सिनोजेन-प्रेरित, आनुवंशिक रूप से इंजीनियर मॉडल, और रोगी-व्युत्पन्न विद्वेष) 2,6 में कई प्रीक्लिनिकल मॉडल विकसित किए गए हैं। आनुवंशिक रूप से इंजीनियर माउस मॉडल (जीईएमएम) मूत्राशय के कैंसर जीव विज्ञान में कई अनुप्रयोगों के लिए उपयोगी होते हैं, जिसमें ट्यूमर फेनोटाइप के विश्लेषण, उम्मीदवार जीन और / या सिग्नलिंग मार्गों की यांत्रिक जांच, और चिकित्सीय प्रतिक्रियाओं 6,7 के प्रीक्लिनिकल मूल्यांकन शामिल हैं। जीईएमएम एक या एक से अधिक ट्यूमर सप्रेसर जीन में आनुवंशिक विलोपन को नियंत्रित करने के लिए साइट-विशिष्ट रिकॉम्बिनेस (क्रे-लोक्सपी) का उपयोग कर सकते हैं। कई जीन विलोपन के साथ वांछित जीईएमएम उत्पन्न करने की प्रक्रिया समय लेने वाली, श्रमसाध्य और महंगीहै 5. इस विधि का समग्र लक्ष्य सामान्य माउस यूरोथेलियल कोशिकाओं से मूत्राशय ट्रिपल नॉकआउट (टीकेओ) मॉडल स्थापित करने के लिए पूर्व विवो क्रे डिलीवरी की एक तेजी से और कुशल विधि विकसित करना है जो ट्रिपल फ्लोक्स्ड एलील्स (टीआरपी 53, पीटीएन, और आरबी 1) 8 ले जाते हैं। पूर्व विवो विधि का प्रमुख लाभ तेजी से वर्कफ़्लो (माउस प्रजनन के वर्षों के बजाय 1-2 सप्ताह) है। यह लेख फ्लोक्स्ड एलील्स, एक्स विवो एडेनोवायरस ट्रांसडक्शन, ऑर्गेनॉइड संस्कृतियों, और इन विट्रो में और इम्यूनोकॉम्पिटेंट सी 57 बीएल / 6 जे चूहों में विवो लक्षण वर्णन के साथ सामान्य यूरोथेलियल कोशिकाओं की कटाई के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन करता है। इस विधि का उपयोग आगे इम्यूनोकॉम्पीटेंट चूहों में नैदानिक रूप से प्रासंगिक मूत्राशय के कैंसर ऑर्गेनोइड्स उत्पन्न करने के लिए किया जा सकता है, जो फ्लोक्स्ड एलील्स के किसी भी संयोजन को परेशान करते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
जीईएमएम सामान्य कोशिकाओं से शुरू किए गए कैंसर मॉडलिंग के लिए सोने के मानक रहे हैं, जिससे संभावित ऑन्कोजेनिक गड़बड़ी (ऑन्कोजीन सक्रियण और / या ट्यूमर सप्रेसर्स के नुकसान) के परिणामों का कड़ाई से परीक्ष?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस शोध कार्य को एनआईएच अनुदान, के 08 सीए 252161 (क्यूएल), आर 01 सीए 234162, और आर 01 सीए 207757 (डीडब्ल्यूजी), पी 30 सीए 016056 (एनसीआई कैंसर सेंटर कोर सपोर्ट ग्रांट), रोसवेल पार्क एलायंस फाउंडेशन और फ्रेंड्स ऑफ यूरोलॉजी फाउंडेशन द्वारा भाग में समर्थित किया गया था। हम पांडुलिपि को प्रूफरीडिंग करने के लिए मारिसा ब्लास्क और मिला पाखोमोवा को धन्यवाद देते हैं।
Materials
| 100 μm sterile cell strainer | Corning | 431752 | |
| 1 mL syringe | BD | 309659 | |
| 25G 1.5 inches needle | EXELINT International | 26406 | |
| Adenovirus (Ad5CMVCre High Titer, 1E11 pfu/ml) | UI Viral Vector Core | VVC-U of Iowa-5-HT | |
| C57 BL/6J | Jackson Lab | 000664 | |
| Charcoal-stripped FBS | Gibco | A3382101 | |
| Collagenase/hyaluronidase | Stemcell Technologies | 07912 | |
| Dispase | Stemcell Technologies | 07913 | |
| DPBS, 1x | Corning | 21-031-CV | |
| L-glutamine substitute (GlutaMAX) | Gibco | 35-050-061 | |
| Mammary Epithelial Cell Growth medium | Lonza | CC-3150 | |
| Matrix extracts from Engelbreth–Holm–Swarm mouse sarcomas (Matrigel) | Corning | CB-40234 | |
| Monoclonal mouse anti-CK20 | DAKO | M7019 | IF 1:100 |
| Monoclonal mouse anti-CK7 | Santa Cruz Biotechnology | SC-23876 | IHC 1:50 |
| Monoclonal mouse anti-p63 | Abcam | ab735 | IHC 1:100, IF 1:50 |
| Monoclonal mouse anti-Upk3 | Fitzgerald | 10R-U103A | IHC 1:50 |
| Monoclonal mouse anti-Vimentin | Santa Cruz Biotechnology | SC-6260 | IF 1:100 |
| Monoclonal rat anti-CK8 | Developmental Studies Hybridoma Bank | TROMA-I-s | IF 1:100 |
| HERAcell vios 160i CO2 incubator | Thermo Fisher | 51033557 | |
| Polyclonal chicken anti-CK5 | Biolegend | 905901 | IF 1:500 |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | |
| Recombinant enzyme of trypsin substitute (TrypLE Express Enzyme) | Thermo Fisher | 12605036 | |
| Signature benchtop shaking incubator Model 1575 | VWR | 35962-091 | |
| Specimen Processing Gel (HistoGel) | Thermo Fisher | HG-4000-012 | |
| Surgical blade size 10 | Integra Miltex | 4-110 | |
| Sorvall T1 centrifuge | Thermo Fisher | 75002383 | |
| Y-27632 | Selleckchem | S1049 |
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