Eks Vivo Organoid modell av Adenovirus-Cre medierte genslettinger i mus urotelceller
Summary
Denne protokollen beskriver prosessen med generering og karakterisering av mus urothelial organoider som skjuler slettinger i gener av interesse. Metodene inkluderer høsting av mus urothelial celler, ex vivo transduksjon med adenovirus kjøring Cre uttrykk med en CMV promotør, og in vitro samt in vivo karakterisering.
Abstract
Blærekreft er et undervurdert område, spesielt i genmodifiserte musemodeller (GEMMs). Innavlede GEMMs med vevsspesifikke Cre- og loxP-nettsteder har vært gullstandardene for betinget eller inducible genmålretting. For å gi raskere og mer effektive eksperimentelle modeller, utvikles et ex vivo organoid kultursystem ved hjelp av adenovirus Cre og normale urothelialceller som bærer flere loxP-alleler av tumordemperne Trp53, Pten og Rb1. Normale urotelceller er enzymatisk disassosiert fra fire blærer med trippel floxed mus (Trp53f/f: Ptenf/f: Rb1f/f). De urotheliale cellene transduseres ex vivo med adenovirus-Cre drevet av en CMV-promotor (Ad5CMVCre). De transinduserte blæreorganoidene dyrkes, forplantes og karakteriseres in vitro og in vivo. PCR brukes til å bekrefte gensletting i Trp53, Pten og Rb1. Immunfluorescens (IF) farging av organoider viser positivt uttrykk for uroteliale avstamningsmarkører (CK5 og p63). Organoidene injiseres subkutant i vertsmus for tumorutvidelse og serielle passasjer. Immunhistokjemien (IHC) av xenografts viser positivt uttrykk for CK7, CK5 og p63 og negativt uttrykk for CK8 og Uroplakin 3. Oppsummert er adenovirusmediert gensletting fra mus urothelialceller konstruert med loxP-nettsteder en effektiv metode for raskt å teste det tumorigeniske potensialet til definerte genetiske endringer.
Introduction
Blærekreft er den fjerde vanligste kreftformen hos menn og rammer mer enn 80.000 mennesker årlig i USA1. Platinabasert kjemoterapi har vært standarden for omsorg for pasienter med avansert blærekreft i mer enn tre tiår. Landskapet av blærekreft behandling har blitt revolusjonert av den nylige Food and Drug Administration (FDA) godkjenning av immunterapi (anti-PD-1 og anti-PD-L1 immun sjekkpunkthemmere), erdafitinib (en fibroblast vekstfaktor reseptor inhibitor) og enfortumab vedotin (en antistoff-narkotika konjugat)2,3,4. Imidlertid er ingen klinisk godkjente biomarkører tilgjengelige for å forutsi responsen på kjemoterapi eller immunterapi. Det er et kritisk behov for å generere informative prekliniske modeller som kan forbedre forståelsen av mekanismene som driver blærekreftprogresjonen og utvikle prediktive biomarkører for ulike behandlingsmodaliteter.
Et stort hinder i blæreoversettelsesforskning er mangelen på prekliniske modeller som rekapitulerer human blærekreftpatogenese og behandlingsresponser 5,6. Flere prekliniske modeller er utviklet, inkludert in vitro 2D-modeller (cellelinjer eller betinget omprogrammerte celler), in vitro 3D-modeller (organoider, 3D-utskrift) og in vivo-modeller (xenograft, kreftfremkallende, genetisk konstruerte modeller og pasientavledede xenograft)2,6. Genmodifiserte musemodeller (GEMMs) er nyttige for mange anvendelser innen blærekreftbiologi, inkludert analyser av tumorfenotyper, mekanistiske undersøkelser av kandidatgener og/eller signalveier, og den prekliniske evalueringen av terapeutiske responser 6,7. GEMMs kan bruke stedsspesifikke rekombininaer (Cre-loxP) for å kontrollere genetiske slettinger i ett eller flere tumordempergener. Prosessen med å generere ønskede GEMMs med flere genslettinger er tidkrevende, arbeidskrevende ogdyrt 5. Det overordnede målet med denne metoden er å utvikle en rask og effektiv metode for ex vivo Cre-levering for å etablere blære trippel knockout (TKO) modeller fra normale mus urothelialceller som bærer trippel floxed alleler (Trp53, Pten og Rb1)8. Den største fordelen med ex vivo-metoden er den raske arbeidsflyten (1-2 uker i stedet for år med museavl). Denne artikkelen beskriver protokollen for høsting av normale urotelceller med floxed alleler, ex vivo adenovirustransduksjon, organoide kulturer og in vitro og in vivo-karakterisering i immunokortogene C57 BL/6J-mus. Denne metoden kan videre brukes til å generere klinisk relevante blærekreftorganoider i immunompetente mus som skjuler enhver kombinasjon av floxed alleler.
Protocol
Representative Results
Discussion
GEMMs har vært gullstandardene for kreftmodellering initiert fra normale celler, slik at konsekvensene av potensielle onkogene perturbasjoner (oncogene aktivering og / eller tap av tumordempere) kan testes grundig. Her gis en rask og effektiv protokoll for å generere blærekreftorganoider via ex vivo genredigering av normale mus urothelialceller som bærer floxed alleler i gener av interesse. H&E- og IHC-farging viser at TKO-organoider viser histologi i samsvar med høyverdig urothelial urothelium, med squamou…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette forskningsarbeidet ble delvis støttet av NIH Grants, K08CA252161(Q.L.), R01CA234162 og R01 CA207757 (D.W.G.), P30CA016056 (NCI Cancer Center Core Support Grant), Roswell Park Alliance Foundation og Friends of Urology Foundation. Vi takker Marisa Blask og Mila Pakhomova for korrekturlesing av manuskriptet.
Materials
| 100 μm sterile cell strainer | Corning | 431752 | |
| 1 mL syringe | BD | 309659 | |
| 25G 1.5 inches needle | EXELINT International | 26406 | |
| Adenovirus (Ad5CMVCre High Titer, 1E11 pfu/ml) | UI Viral Vector Core | VVC-U of Iowa-5-HT | |
| C57 BL/6J | Jackson Lab | 000664 | |
| Charcoal-stripped FBS | Gibco | A3382101 | |
| Collagenase/hyaluronidase | Stemcell Technologies | 07912 | |
| Dispase | Stemcell Technologies | 07913 | |
| DPBS, 1x | Corning | 21-031-CV | |
| L-glutamine substitute (GlutaMAX) | Gibco | 35-050-061 | |
| Mammary Epithelial Cell Growth medium | Lonza | CC-3150 | |
| Matrix extracts from Engelbreth–Holm–Swarm mouse sarcomas (Matrigel) | Corning | CB-40234 | |
| Monoclonal mouse anti-CK20 | DAKO | M7019 | IF 1:100 |
| Monoclonal mouse anti-CK7 | Santa Cruz Biotechnology | SC-23876 | IHC 1:50 |
| Monoclonal mouse anti-p63 | Abcam | ab735 | IHC 1:100, IF 1:50 |
| Monoclonal mouse anti-Upk3 | Fitzgerald | 10R-U103A | IHC 1:50 |
| Monoclonal mouse anti-Vimentin | Santa Cruz Biotechnology | SC-6260 | IF 1:100 |
| Monoclonal rat anti-CK8 | Developmental Studies Hybridoma Bank | TROMA-I-s | IF 1:100 |
| HERAcell vios 160i CO2 incubator | Thermo Fisher | 51033557 | |
| Polyclonal chicken anti-CK5 | Biolegend | 905901 | IF 1:500 |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | |
| Recombinant enzyme of trypsin substitute (TrypLE Express Enzyme) | Thermo Fisher | 12605036 | |
| Signature benchtop shaking incubator Model 1575 | VWR | 35962-091 | |
| Specimen Processing Gel (HistoGel) | Thermo Fisher | HG-4000-012 | |
| Surgical blade size 10 | Integra Miltex | 4-110 | |
| Sorvall T1 centrifuge | Thermo Fisher | 75002383 | |
| Y-27632 | Selleckchem | S1049 |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Fuchs, H. E., Jemal, A. Cancer statistics, 2021. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 71 (1), 7-33 (2021).
- Zhu, S., et al. Preclinical models for bladder cancer research. Hematology/Oncology Clinics of North America. 35 (3), 613-632 (2021).
- DeGraff, D. J., et al. Current preclinical models for the advancement of translational bladder cancer research. Molecular Cancer Therapeutics. 12 (2), 121-130 (2013).
- Andreev-Drakhlin, A. Y., et al. The evolving treatment landscape of advanced urothelial carcinoma. Current Opinion in Oncology. 33 (3), 221-230 (2021).
- Mullenders, J., et al. Mouse and human urothelial cancer organoids: A tool for bladder cancer research. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (10), 4567-4574 (2019).
- Kobayashi, T., Owczarek, T. B., McKiernan, J. M., Abate-Shen, C. Modelling bladder cancer in mice: opportunities and challenges. Nature Reviews. Cancer. 15 (1), 42-54 (2015).
- Kersten, K., de Visser, K. E., van Miltenburg, M. H., Jonkers, J. Genetically engineered mouse models in oncology research and cancer medicine. EMBO Molecular Medicine. 9 (2), 137-153 (2017).
- Ku, S. Y., et al. Rb1 and Trp53 cooperate to suppress prostate cancer lineage plasticity, metastasis, and antiandrogen resistance. Science. 355 (6320), 78-83 (2017).
- Lee, S. H., et al. Tumor evolution and drug response in patient-derived organoid models of bladder cancer. Cell. 173 (2), 515-528 (2018).
- Fujii, E., et al. A simple method for histopathological evaluation of organoids. Journal of Toxicologic Pathology. 31 (1), 81-85 (2018).
- Georgas, K. M., et al. An illustrated anatomical ontology of the developing mouse lower urogenital tract. Development. 142 (10), 1893-1908 (2015).
- Santos, C. P., et al. Urothelial organoids originating from Cd49f(high) mouse stem cells display Notch-dependent differentiation capacity. Nature Communication. 10 (1), 4407 (2019).
- Wang, L., et al. A genetically defined disease model reveals that urothelial cells can initiate divergent bladder cancer phenotypes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (1), 563-572 (2020).
- Yang, D., et al. Intertumoral heterogeneity in SCLC is influenced by the cell type of origin. Cancer Discovery. 8 (10), 1316-1331 (2018).
- Sutherland, K. D., et al. Cell of origin of small cell lung cancer: inactivation of Trp53 and Rb1 in distinct cell types of adult mouse lung. Cancer Cell. 19 (6), 754-764 (2011).
- Bottger, F., et al. Tumor heterogeneity underlies differential cisplatin sensitivity in mouse models of small-cell lung cancer. Cell Reports. 27 (11), 3345-3358 (2019).
- Puzio-Kuter, A. M., et al. Inactivation of p53 and Pten promotes invasive bladder cancer. Genes & Development. 23 (6), 675-680 (2009).
- Park, S., et al. Novel mouse models of bladder cancer identify a prognostic signature associated with risk of disease progression. 암 연구학. 81 (20), 5161-5175 (2021).
- Hawley, S. P., Wills, M. K., Jones, N. Adenovirus-mediated genetic removal of signaling molecules in cultured primary mouse embryonic fibroblasts. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (43), e2160 (2010).
- Feng, W., et al. Rapid interrogation of cancer cell of origin through CRISPR editing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (32), 2110344118 (2021).
