Ex Vivo Modelo organoide de deleções genéticas mediadas por Adenovírus-Cre em células uroteliais de camundongos
Summary
Este protocolo descreve o processo de geração e caracterização de organoides uroteliais de camundongos que abrigam exclusões em genes de interesse. Os métodos incluem a colheita de células uroteliais de camundongos, transdução ex vivo com expressão de Adenovírus conduzindo Cre com um promotor de CMV, e caracterização in vitro , bem como caracterização in vivo .
Abstract
O câncer de bexiga é uma área pouco estudada, particularmente em modelos de camundongos geneticamente modificados (GEMMs). Gemm inbred com locais cre e loxP específicos de tecido têm sido os padrões de ouro para direcionamento genético condicional ou indutível. Para fornecer modelos experimentais mais rápidos e eficientes, um sistema de cultura organoide ex vivo é desenvolvido usando adenovírus Cre e células uroteliais normais carregando múltiplos alelos loxP dos supressores tumorais Trp53, Pten e Rb1. As células uroteliais normais são enzimáticamente dissociadas de quatro bexigas de camundongos floxados triplos (Trp53f/f: Ptenf/f: Rb1f/f). As células urotelial são transduzidas ex vivo com adenovírus-Cre impulsionado por um promotor do CMV (Ad5CMVCre). Os organoides da bexiga transduzidas são cultivados, propagados e caracterizados in vitro e in vivo. O PCR é usado para confirmar exclusões genéticas em Trp53, Pten e Rb1. A coloração de imunofluorescência (IF) de organoides demonstra expressão positiva dos marcadores de linhagem urotelial (CK5 e p63). Os organoides são injetados subcutâneamente em camundongos hospedeiros para expansão tumoral e passagens seriais. A imunohistoquímica (IHC) de xenoenxertos exibe expressão positiva de CK7, CK5 e p63 e expressão negativa de CK8 e Uroplakin 3. Em resumo, a exclusão genética mediada por adenovírus de células uroteliais de camundongos projetadas com locais loxP é um método eficiente para testar rapidamente o potencial tumorigênico de alterações genéticas definidas.
Introduction
O câncer de bexiga é o quarto câncer mais comum em homens e afeta mais de 80.000 pessoas anualmente nos Estados Unidos1. A quimioterapia à base de platina tem sido o padrão de cuidado para pacientes com câncer avançado de bexiga há mais de três décadas. A paisagem do tratamento do câncer de bexiga foi revolucionada pela recente aprovação da Food and Drug Administration (FDA) da imunoterapia (anti-PD-1 e inibidores de ponto de verificação imunológica anti-PD-L1), erdafitinib (um inibidor receptor de fator de crescimento do fibroblasto) e enfortumab vedotin (um conjugado de anticorpos)2,3,4. No entanto, não há biomarcadores clinicamente aprovados para prever as respostas à quimioterapia ou à imunoterapia. Há uma necessidade crítica de gerar modelos pré-clínicos informativos que possam melhorar a compreensão dos mecanismos que impulsionam a progressão do câncer de bexiga e desenvolver biomarcadores preditivos para diferentes modalidades de tratamento.
Um grande obstáculo na pesquisa translacional da bexiga é a falta de modelos preclínicos que recapitulem a patogênese do câncer de bexiga humano e as respostasao tratamento 5,6. Vários modelos pré-clínicos foram desenvolvidos, incluindo modelos in vitro 2D (linhas celulares ou células reprogramadas condicionalmente), modelos in vitro 3D (organoides, impressão 3D) e modelos in vivo (xenoenxerto, modelos induzidos pelo carcinogênio, geneticamente modificados e xenot de enxerto derivado do paciente)2,6. Modelos de camundongos geneticamente modificados (GEMMs) são úteis para muitas aplicações na biologia do câncer de bexiga, incluindo análises de fenótipos tumorais, investigações mecanicistas de genes candidatos e/ou caminhos de sinalização, e a avaliação pré-clínica das respostas terapêuticas 6,7. Os GEMMs podem utilizar recombinases específicas do local (Cre-loxP) para controlar exclusões genéticas em um ou mais genes supressores de tumores. O processo de geração de GEMMs desejados com múltiplas exclusões genéticas é demorado, trabalhoso e caro5. O objetivo geral deste método é desenvolver um método rápido e eficiente de entrega ex vivo Cre para estabelecer modelos de nocaute triplo de bexiga (TKO) a partir de células uroteliais normais do rato carregando alelos floxados triplos (Trp53, Pten e Rb1)8. A maior vantagem do método ex vivo é o fluxo de trabalho rápido (1-2 semanas em vez de anos de criação de camundongos). Este artigo descreve o protocolo de colheita de células uroteliais normais com alelos floxados, transdução ex vivo adenovírus, culturas organoides e caracterização in vitro e in vivo em camundongos imunocompetuntes C57 BL/6J. Este método pode ser usado para gerar organoides clinicamente relevantes para o câncer de bexiga em camundongos imunocompetuntes que abrigam qualquer combinação de alelos floxados.
Protocol
Representative Results
Discussion
Gemms têm sido os padrões de ouro para a modelagem do câncer iniciada a partir de células normais, permitindo que as consequências de potenciais perturbações oncogênicas (ativação oncogênica e/ou perda de supressores tumorais) sejam testadas rigorosamente. Aqui, um protocolo rápido e eficiente é fornecido para gerar organoides de câncer de bexiga através da edição de genes ex vivo de células uroteliais normais do camundongo carregando alelos floxados em genes de interesse. As manchas de H&E e I…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho de pesquisa foi apoiado em parte por NIH Grants, K08CA252161 (Q.L.), R01CA234162 e R01 CA207757 (D.W.G.), P30CA016056 (NCI Cancer Center Core Support Grant), a Roswell Park Alliance Foundation e a Friends of Urology Foundation. Agradecemos a Marisa Blask e Mila Pakhomova pela revisão do manuscrito.
Materials
| 100 μm sterile cell strainer | Corning | 431752 | |
| 1 mL syringe | BD | 309659 | |
| 25G 1.5 inches needle | EXELINT International | 26406 | |
| Adenovirus (Ad5CMVCre High Titer, 1E11 pfu/ml) | UI Viral Vector Core | VVC-U of Iowa-5-HT | |
| C57 BL/6J | Jackson Lab | 000664 | |
| Charcoal-stripped FBS | Gibco | A3382101 | |
| Collagenase/hyaluronidase | Stemcell Technologies | 07912 | |
| Dispase | Stemcell Technologies | 07913 | |
| DPBS, 1x | Corning | 21-031-CV | |
| L-glutamine substitute (GlutaMAX) | Gibco | 35-050-061 | |
| Mammary Epithelial Cell Growth medium | Lonza | CC-3150 | |
| Matrix extracts from Engelbreth–Holm–Swarm mouse sarcomas (Matrigel) | Corning | CB-40234 | |
| Monoclonal mouse anti-CK20 | DAKO | M7019 | IF 1:100 |
| Monoclonal mouse anti-CK7 | Santa Cruz Biotechnology | SC-23876 | IHC 1:50 |
| Monoclonal mouse anti-p63 | Abcam | ab735 | IHC 1:100, IF 1:50 |
| Monoclonal mouse anti-Upk3 | Fitzgerald | 10R-U103A | IHC 1:50 |
| Monoclonal mouse anti-Vimentin | Santa Cruz Biotechnology | SC-6260 | IF 1:100 |
| Monoclonal rat anti-CK8 | Developmental Studies Hybridoma Bank | TROMA-I-s | IF 1:100 |
| HERAcell vios 160i CO2 incubator | Thermo Fisher | 51033557 | |
| Polyclonal chicken anti-CK5 | Biolegend | 905901 | IF 1:500 |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | |
| Recombinant enzyme of trypsin substitute (TrypLE Express Enzyme) | Thermo Fisher | 12605036 | |
| Signature benchtop shaking incubator Model 1575 | VWR | 35962-091 | |
| Specimen Processing Gel (HistoGel) | Thermo Fisher | HG-4000-012 | |
| Surgical blade size 10 | Integra Miltex | 4-110 | |
| Sorvall T1 centrifuge | Thermo Fisher | 75002383 | |
| Y-27632 | Selleckchem | S1049 |
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