Avançando a imagem de alta resolução de conjuntos de vírus em líquido e gelo
Summary
Aqui os protocolos são descritos para preparar conjuntos de vírus adequados para análise líquido-EM e crio-EM em nanoescala usando microscopia eletrônica de transmissão.
Abstract
O interesse na microscopia líquida-eletrônica (EM-líquido) disparou nos últimos anos, já que os cientistas agora podem observar processos em tempo real em nanoescala. É extremamente desejável emparelhar informações crio-EM de alta resolução com observações dinâmicas, pois muitos eventos ocorrem em escalas de tempo rápidas – na faixa de milissegundos ou mais rápido. Um melhor conhecimento de estruturas flexíveis também pode ajudar no projeto de novos reagentes para combater patógenos emergentes, como o SARS-CoV-2. Mais importante ainda, a visualização de materiais biológicos em um ambiente fluido fornece um vislumbre único de seu desempenho no corpo humano. Apresentamos aqui métodos recém-desenvolvidos para investigar as propriedades em nanoescala de conjuntos de vírus em gelo líquido e vítreo. Para atingir esse objetivo, amostras bem definidas foram utilizadas como sistemas modelo. Comparações lado a lado dos métodos de preparação de amostras e informações estruturais representativas são apresentadas. Características sub-nanômetros são mostradas para estruturas resolvidas na faixa de ~3,5-Å-10 Å. Outros resultados recentes que apoiam essa estrutura complementar incluem insights dinâmicos de candidatas a vacinas e terapias baseadas em anticorpos com imagens em líquido. No geral, essas aplicações correlativas avançam nossa capacidade de visualizar a dinâmica molecular, fornecendo um contexto único para seu uso na saúde e na doença humanas.
Introduction
A pesquisa biomédica melhora nossa compreensão da saúde e da doença humanas através do desenvolvimento de novas tecnologias. A imagem de alta resolução está transformando nossa visão do nanomundo – permitindo-nos estudar células e moléculas em detalhes requintados 1,2,3,4,5. Informações estáticas de componentes dinâmicos, como polímeros moles, conjuntos de proteínas ou vírus humanos, revelam apenas um instantâneo limitado de sua narrativa complexa. Para entender melhor como as entidades moleculares operam, sua estrutura e função devem ser investigadas em conjunto.
Avanços recentes na produção de materiais como grafeno atomicamente fino ou microchips à base de silício oferecem novas oportunidades para análise estrutura-função em tempo real usando microscópios eletrônicos de transmissão (METs). Esses materiais podem criar câmaras hermeticamente seladas para imagens EM ao vivo 6,7,8,9,10,11. O novo campo de EM-líquido, o correlato de temperatura ambiente com o crio-EM, fornece visões sem precedentes de materiais duros ou macios em solução, permitindo que os cientistas estudem simultaneamente a estrutura e a dinâmica de sua amostra. As aplicações de EM líquido incluem registros em tempo real de nanopartículas terapêuticas interagindo com células-tronco cancerígenas, bem como mudanças nos meandros moleculares de patógenos virais12,13,14.
Assim como os avanços metodológicos estimularam a revolução da resolução no campo da crio-EM, novas técnicas e métodos são necessários para ampliar o uso do líquido-EM como uma ferramenta de alto rendimento para a comunidade científica. O objetivo geral dos métodos apresentados aqui é simplificar os protocolos de preparação de amostras líquidas-EM. A lógica por trás das técnicas desenvolvidas é empregar novos projetos de microchips e dispositivos de carregador automático, adequados para a coleta de dados líquidos e crio-EM (Figura 1)7,14,15,16,17. Os conjuntos são selados mecanicamente usando clipes de grade padrão para instrumentos automatizados, como o Krios, que pode acomodar várias amostras por sessão ou um TEM F200C (Figura 2). Essa metodologia expande o uso de imagens de alta resolução para além das aplicações padrão de crio-EM, demonstrando propósitos mais amplos para análise de materiais em tempo real.
No presente artigo em vídeo, são apresentados protocolos para a preparação de conjuntos de vírus em líquido com e sem suportes de espécimes comercialmente disponíveis. Usando o suporte de amostra especializado para EM-líquido, espécimes líquidos finos podem fornecer informações estruturais comparáveis às amostras crio-EM, bem como insights dinâmicos dos espécimes. Também são demonstrados métodos para preparar amostras líquidas usando ferramentas de carregador automático para rotinas de alto rendimento. A principal vantagem sobre outras técnicas é que a produção automatizada de amostras permite que o usuário avalie rapidamente suas amostras quanto à espessura ideal e dosagem de elétrons antes da coleta de dados. Essa técnica de triagem identifica rapidamente áreas ideais para gravações em tempo real em líquido ou gelo12,14,18,19. Para fins de determinação da estrutura 3D, o líquido-EM pode complementar os métodos crio-EM estabelecidos há muito tempo implementados no crio-EM. Os leitores que empregam tecnologias convencionais de TEM ou crio-EM podem considerar o uso de fluxos de trabalho líquido-EM para fornecer observações novas e dinâmicas de suas amostras de uma maneira que complemente suas estratégias atuais.
As amostras de vírus utilizadas neste protocolo incluem o vírus adenoassociado purificado subtipo 3 (AAV) obtido como presente e cultivado em condições padrão12. Também foram utilizados conjuntos subvirais não infecciosos do SARS CoV-2 derivados do soro de pacientes com COVID-1912 e obtidos de fonte comercial. Finalmente, partículas purificadas de dupla camada (DLPs) do rotavírus símio (cepa SA11) foram obtidas do laboratório da Dra. Sarah M. McDonald Esstman na Wake Forest University e cultivadas usando condições padrão 6,17. Os pacotes de software descritos aqui estão disponíveis gratuitamente e os links foram fornecidos na seção Tabela de Materiais.
Protocol
Representative Results
Discussion
Novas oportunidades são apresentadas para agilizar os fluxos de trabalho atuais de EM líquido usando novas ferramentas e tecnologias automatizadas adaptadas do campo crio-EM. As aplicações que envolvem a nova técnica de sanduíche de microchip são significativas em relação a outros métodos, pois permitem a análise de imagens de alta resolução em gelo líquido ou vítreo. Uma das etapas mais críticas do protocolo é a produção de espécimes com a espessura líquida ideal para visualizar detalhes requintados…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores reconhecem o Dr. Luk H. Vandenberghe (Harvard Medical School, Departamento de Oftalmologia) por fornecer AAV-3 purificado. Este trabalho foi apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde e pelo Instituto Nacional do Câncer (R01CA193578, R01CA227261, R01CA219700 a D.F.K.).
Materials
| Acetone | Fisher Scientific | A11-1 | 1 Liter |
| Autoloader clipping tool | ThermoFisher Scientific | N/A | Also SubAngstrom supplier |
| Autoloader grid clips | ThermoFisher Scientific | N/A | top and bottom clips |
| Carbon-coated gold EM grids | Electron Microcopy Sciences | CF400-AU-50 | 400-mesh, 5-nm thickness |
| COVID-19 patient serum | RayBiotech | CoV-Pos-S-500 | 500 microliters of PCR+ serum |
| Methanol | Fisher Scientific | A412-1 | 1 Liter |
| Microwell-integrad microchips | Protochips, Inc. | EPB-42A1-10 | 10×10-mm window arrays |
| TEMWindows microchips | Simpore Inc. | SN100-A10Q33B | 9 large windows, 10-nn thick |
| TEMWindows microchips | Simpore, Inc. | SN100-A05Q33A | 9 small windows, 5-nm thick |
| Top microchips | Protochips, Inc. | EPT-50W | 500 mm x 100 mm window |
| Whatman #1 filter paper | Whatman | 1001 090 | 100 pieces, 90 mm |
| Equipment | |||
| DirectView direct electron detector | Direct Electron | 6-micron pixel spacing | |
| Falcon 3 EC direct electron detector | ThermoFisher Scientific | 14-micron pixel spacing | |
| Gatan 655 Dry pump station | Gatan, Inc. | Pump holder tip to 10-6 range | |
| Mark IV Vitrobot | ThermoFisher Scientific | state-of-the-art specimen preparation unit | |
| PELCO easiGlow, glow discharge unit | Ted Pella, Inc. | Negative polarity mode | |
| Poseidon Select specimen holder | Protochips, Inc. | FEI compatible;specimen holder | |
| Talos F200C TEM | ThermoFisher Scientific | 200 kV; Liquid-TEM | |
| Titan Krios G3 | ThermoFisher Scientific | 300 kV; Cryo-TEM | |
| Freely available software | Website link | Comments (optional) | |
| cryoSPARC | https://cryosparc.com/ | other image processing software | |
| CTFFIND4 | https://grigoriefflab.umassmed.edu/ctffind4 | CTF finding program | |
| MotionCorr2 | https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software | ||
| RELION | https://www3.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion/index.php?title=Main_Page | ||
| SerialEM | https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/ | ||
| UCSF Chimera | https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ | molecular structure analysis software package |
References
- Deng, W., et al. Assembly, structure, function and regulation of type III secretion systems. Nature Reviews Microbiology. 15 (6), 323-337 (2017).
- Oikonomou, C. M., Chang, Y. -. W., Jensen, G. J. A new view into prokaryotic cell biology from electron cryotomography. Nature Reviews Microbiology. 14 (4), 205-220 (2016).
- Murata, K., Wolf, M. Cryo-electron microscopy for structural analysis of dynamic biological macromolecules. Biochimica et Biophysica Acta. General Subjects. 1862 (2), 324-334 (2018).
- DiMaio, F., et al. Atomic accuracy models from 4.5 Å cryo-electron microscopy data with density-guided iterative local refinement. Nature Methods. 12 (4), 361-365 (2015).
- Frank, J., et al. A model of protein synthesis based on cryo-electron microscopy of the E. coli ribosome. Nature. 376 (6539), 441-444 (1995).
- Dukes, M. J., Gilmore, B. L., Tanner, J. R., McDonald, S. M., Kelly, D. F. In situ TEM of biological assemblies in liquid. Journal of Visualized Experiments. (82), e50936 (2013).
- Dearnaley, W. J., et al. Liquid-cell electron tomography of biological systems. Nano Letters. 19 (10), 6734-6741 (2019).
- Park, J., et al. Direct observation of wet biological samples by graphene liquid cell transmission electron microscopy. Nano Letters. 15 (7), 4737-4744 (2015).
- Chen, Q., et al. 3D Motion of DNA-Au nanoconjugates in graphene liquid cell electron microscopy. Nano Letters. 13 (9), 4556-4561 (2013).
- Yuk, J. M., et al. High-resolution EM of colloidal nanocrystal growth using graphene liquid cells. Science. 336 (6077), 61-64 (2012).
- Wang, X., Yang, J., Andrei, C. M., Soleymani, L., Grandfield, K. Biomineralization of calcium phosphate revealed by in situ liquid-phase electron microscopy. Communications Chemistry. 1, 80 (2018).
- Jonaid, G., et al. High-resolution imaging of human viruses in liquid droplets. Advanced Materials. 33 (37), 2103221 (2021).
- Pohlmann, E. S., et al. Real-time visualization of nanoparticles interacting with glioblastoma stem cells. Nano Letters. 15 (4), 2329-2335 (2015).
- Jonaid, G. M., et al. Automated tools to advance high-resolution imaging in liquid. Microscopy and Microanalysis. , 1-10 (2022).
- Varano, A. C., et al. Customizable cryo-EM chips improve 3D analysis of macromolecules. Microscopy and Microanalysis. 25, 1310-1311 (2019).
- Alden, N. A., et al. Cryo-EM-on-a-chip: Custom-designed substrates for the 3D analysis of macromolecules. Small. 15 (21), 1900918 (2019).
- Tanner, J. R., et al. Cryo-SiN – An alternative substrate to visualize active viral assemblies. Journal of Analytical and Molecular Techniques. , (2016).
- Solares, M. J., et al. Microchip-based structure determination of disease-relevant p53. Analytical Chemistry. 92 (23), 15558-15564 (2020).
- Casasanta, M. A., et al. Microchip-based structure determination of low-molecular weight proteins using cryo-electron microscopy. Nanoscale. 13 (15), 7285-7293 (2021).
- Mastronarde, D. N. Advanced data acquisition from electron microscopes with SerialEM. Microscopy and Microanalysis. 24, 864-865 (2018).
- Scheres, S. H. W. RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).
- Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
- Pettersen, E. F., et al. UCSF Chimera—A visualization system for exploratory research and analysis. Journal of Computational Chemistry. 25 (13), 1605-1612 (2004).
- Goddard, T. D., Huang, C. C., Ferrin, T. E. Visualizing density maps with UCSF Chimera. Journal of Structural Biology. 157 (1), 281-287 (2007).
- Lerch, T. F., Xie, Q., Chapman, M. S. The structure of adeno-associated virus serotype 3B (AAV-3B): Insights into receptor binding and immune evasion. Virology. 403 (1), 26-36 (2010).
- Sharma, G., et al. Affinity grid-based cryo-EM of PKC binding to RACK1 on the ribosome. Journal of Structural Biology. 181 (2), 190-194 (2013).
- Kiss, G., et al. Capturing enveloped viruses on affinity grids for downstream cryo-electron microscopy applications. Microscopy and Microanalysis. 20 (1), 164-174 (2014).
- Degen, K., Dukes, M., Tanner, J. R., Kelly, D. F. The development of affinity capture devices—a nanoscale purification platform for biological in situ transmission electron microscopy. Rsc Advances. 2 (6), 2408-2412 (2012).
- Hui, S. W., Parsons, D. F. Electron diffraction of wet biological membranes. Science. 184 (4132), 77-78 (1974).
- Hui, S. W., Parsons, D. F., Cowden, M. Electron diffraction of wet phospholipid bilayers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 71 (12), 5068-5072 (1974).
- Parsons, D. F., Matricardi, V. R., Moretz, R. C., Turner, J. N. Electron microscopy and diffraction of wet unstained and unfixed biological object. Advances in Biological and Medical Physics. 15, 161-270 (1974).
- Parsons, D. F. Structure of wet specimens in electron microscopy. Improved environmental chambers make it possible to examine wet specimens easily. Science. 186 (4162), 407-414 (1974).
- Matricardi, V. R., Moretz, R. C., Parsons, D. F. Electron diffraction of wet proteins: Catalase. Science. 177 (4045), 268-270 (1972).
