Fabrication de microgels de chitosane-genipine à taille contrôlée et sans émulsion pour des applications d’ingénierie tissulaire

Summary

Le présent protocole décrit une méthode non basée sur l’émulsion pour la fabrication de microgels de chitosane-genipine. La taille de ces microgels peut être contrôlée avec précision et ils peuvent présenter un gonflement dépendant du pH, se dégrader in vivo et être chargés de molécules thérapeutiques qui se libèrent au fil du temps de manière soutenue, ce qui les rend très pertinents pour les applications d’ingénierie tissulaire.

Abstract

Les microgels de chitosane présentent un intérêt considérable dans l’ingénierie tissulaire en raison de leur large éventail d’applications, de leur faible coût et de leur immunogénicité. Cependant, les microgels de chitosane sont généralement fabriqués à l’aide de méthodes d’émulsion qui nécessitent des rinçages au solvant organique, qui sont toxiques et nocifs pour l’environnement. Le présent protocole présente une méthode rapide, non cytotoxique et sans émulsion pour fabriquer des microgels de chitosane-genipine sans avoir besoin de rinçages au solvant organique. Les microgels décrits ici peuvent être fabriqués avec un contrôle précis de la taille. Ils présentent une libération prolongée de biomolécules, ce qui les rend très pertinents pour l’ingénierie tissulaire, les biomatériaux et la médecine régénérative. Le chitosane est réticulé avec la genipine pour former un réseau d’hydrogel, puis passé à travers un filtre à seringue pour produire les microgels. Les microgels peuvent être filtrés pour créer une gamme de tailles, et ils montrent un gonflement dépendant du pH et se dégradent avec le temps de manière enzymatique. Ces microgels ont été utilisés dans un modèle de lésion de plaque de croissance de rat et il a été démontré qu’ils favorisaient une réparation accrue du tissu cartilagineux et montraient une dégradation complète à 28 jours in vivo. En raison de leur faible coût, de leur grande commodité et de leur facilité de fabrication avec des matériaux cytocompatibles, ces microgels de chitosane présentent une technologie passionnante et unique en ingénierie tissulaire.

Introduction

La plaque de croissance, également connue sous le nom de physis, est la structure cartilagineuse située à l’extrémité des os longs qui médie la croissance chez les enfants. Si la plaque de croissance se blesse, un tissu de réparation connu sous le nom de « barre osseuse » peut se former, ce qui interrompt la croissance normale et peut provoquer des défauts de croissance ou des déformations angulaires. Les données épidémiologiques ont montré que 15% à 30% de toutes les blessures squelettiques infantiles sont liées à la plaque de croissance. La formation de barres osseuses se produit dans jusqu’à 30% de ces blessures, ce qui fait des lésions de la plaque de croissance et de leur traitement associé un problème de manifestation clinique important ^1,2,3,4. Lorsque la formation d’une barre osseuse se produit, la voie de traitement la plus courante consiste à résectionner la barre osseuse et à insérer un matériau interpositionnel, tel que le silicium ou le tissu adipeux⁵. Cependant, les patients qui subissent une chirurgie de résection de la barre osseuse ont souvent un mauvais pronostic pour un rétablissement complet, car il n’existe actuellement aucun traitement capable de réparer complètement une plaque de croissance blessée ^6,7,8. À la lumière de ces lacunes, il existe un besoin critique de stratégies efficaces pour traiter les blessures de la plaque de croissance, à la fois pour prévenir la formation d’une barre osseuse et pour régénérer le tissu cartilagineux physaire sain.

Les microparticules d’hydrogel, ou microgels, ont récemment gagné en intérêt en tant qu’échafaudages injectables pouvant fournir une libération prolongée de produits thérapeutiques⁹. En raison de leur grande accordabilité et de leur biocompatibilité, les microgels sont également bien adaptés à l’encapsulation de facteurs bioactifs ou de cellules. Les microgels peuvent être fabriqués à partir de divers matériaux, allant des polymères synthétiques, tels que le polyéthylène glycol (PEG), aux polymères naturels comme l’alginate ou le chitosane 10,11,12. Il a été démontré que le chitosane a plusieurs effets bénéfiques pour l’ingénierie tissulaire, tels que sa capacité à déstabiliser la membrane externe des bactéries à Gram négatif, offrant ainsi une activité antimicrobienne inhérente^{1 3,14}. De plus, le chitosane est rentable, interactif sur les cellules et facilement modifié à l’aide de sa structure contenant des amines. Les microgels à base de chitosane promettent une stratégie de biomatériau pour l’administration de médicaments et la signalisation des matériaux qui peuvent favoriser la régénération des tissus tout en prévenant les infections bactériennes. Cependant, les microgels de chitosane sont souvent fabriqués avec un large éventail de techniques qui nécessitent un équipement spécial, des techniques d’émulsion ou des rinçages au solvant cytotoxique. Par exemple, certaines études ont fabriqué des microgels de chitosane avec des méthodes à base d’émulsion, mais ces protocoles nécessitent des rinçages au solvant et des réticulants cytotoxiques, ce qui pourrait annuler leur traduction en milieu clinique^15,16. D’autres études ont utilisé des approches de microfluidique ou d’électropulvérisation pour fabriquer des microgels de chitosane, qui nécessitent un équipement, une préparation et une formation spéciaux^17,18. Les microgels de chitosane sont également couramment fabriqués avec un processus goutte à goutte de réticulant en solution de chitosane; cependant, cette méthode dépend fortement de la viscosité de la solution, de la concentration en polymère et du débit, ce qui rend difficile le contrôle de la taille et de la dispersion des microgels^19,20. Inversement, la méthode de fabrication de microgels décrite dans le présent document ne nécessite aucun équipement spécialisé ni rinçage au solvant, ce qui rend ces microgels viables pour la fabrication dans presque tous les laboratoires ou environnements. Par conséquent, ces microgels représentent des biomatériaux très pertinents pour un véhicule d’administration de médicaments rapide, rentable et facile à produire pour de nombreuses applications.

En modulant la composition et les caractéristiques matérielles d’un microgel, les chercheurs peuvent obtenir un contrôle précis sur le microenvironnement cellulaire, dirigeant ainsi le comportement cellulaire d’une manière dépendante du matériau. Les microgels peuvent être utilisés seuls ou combinés avec des systèmes de biomatériaux en vrac pour conférer des fonctionnalités spécifiques, telles que la libération prolongée de facteurs bioactifs ou une signalisation spéciale précise pour les cellules natives ou exogènes. Les biomatériaux et les microgels sont devenus des voies de traitement attrayantes pour les lésions des plaques de croissance. Des efforts importants ont été consacrés au développement de biomatériaux à base d’alginate et de chitosane pour traiter les lésions des plaques de croissance 21,22,23,24,25. En raison de la nature temporelle dynamique de l’ossification de la plaque de croissance et de l’allongement osseux, le mécanisme de formation de la barre osseuse n’est pas entièrement compris. Par conséquent, plusieurs modèles animaux ont été développés pour mieux élucider les mécanismes de l’ossification endochondrale et de la formation de barres osseuses, comme chez les rats, les lapins et les moutons 26,27,28. L’un de ces modèles est un modèle de blessure de plaque de croissance de rat, qui utilise un défaut de trou de forage dans le tibia du rat pour produire une barre osseuse de manière prévisible et reproductible et imite les blessures humaines dans les trois zones de la plaque de croissance^29,30. Plusieurs stratégies basées sur les biomatériaux pour traiter les lésions des plaques de croissance ont été testées à l’aide de ce modèle. En outre, deux méthodes différentes pour fabriquer des microgels de chitosane ont été développées, qui peuvent être utilisées comme un système de biomatériaux injectables qui libère des produits thérapeutiques de manière soutenue^10,31. Ces microgels ont été utilisés dans un modèle de blessure physique chez le rat, et ils ont montré une amélioration de la régénération du cartilage³¹ lors de la libération de SDF-1a et TGF-b3. Les techniques fournies dans ce protocole décrivent les méthodes développées pour fabriquer ces microgels de chitosane, qui peuvent ensuite être utilisés dans une grande variété d’applications d’ingénierie tissulaire. Par exemple, des études récentes ont utilisé des microgels de chitosane thermo- ou magento-responsive pour des applications d’administration contrôlée de médicaments oncologiques^32,33.

Protocol

Toutes les procédures animales ont été approuvées par le comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université du Colorado à Denver. Des rats Sprague-Dawley mâles âgés de 6 semaines ont été utilisés pour la présente étude. Le modèle de blessure à la plaque de croissance du rat a été créé à la suite d’un rapport30 publié précédemment. 1. Préparation du polymère chitosane Obtenir du chitosan…

Representative Results

La fabrication réussie de microgels de chitosane repose sur la réaction de réticulation entre la genipine et le chitosane, impliquant spécifiquement les amines sur les chaînes de polymères de chitosane. Contrairement à d’autres techniques de fabrication de microgels, cette méthode ne nécessite pas d’émulsions ou de rinçages au solvant et peut être rapidement et facilement réalisée avec un équipement peu coûteux. Un indicateur caractéristique de la fabrication réussie de microgels est le changement d…

Discussion

Les microgels ont fait l’objet de nombreuses recherches ces dernières années en raison de leur haut niveau d’applicabilité à diverses fins, telles que l’administration de médicaments ou l’encapsulation cellulaire⁹. La facilité de fabrication de constructions de biomatériaux à micro-échelle est d’une importance significative dans l’ingénierie tissulaire, car elle permet aux chercheurs de développer des stratégies à base d’hydrogel à une taille et à une échelle de temps…

Materials

Acetic acid	SigmaAldrich	AX0073
BD Luer-Lock Syringe	Fisher Scientific	14-823-16E
Büchner Funnel	Fisher Scientific	FB966F	100 mm diameter
Chitosan (low molecular weight)	SigmaAldrich	448869	75-80% deacetylation
Dialysis Membrane Tubing	Fisher Scientific	08-670-5C	3500 MWCO
Ethanol	SigmaAldrich	493538
Genipin	SigmaAldrich	G4796
Heracell 150i Incubator	ThermoFisher	50116047
Parafilm	Fisher Scientific	13-374-12
Recombinant human SDF-1a	Peprotech	300-28A
Recombinant human TGF-b3	Peprotech	100-36E
Whatman Filter Paper Grade 540	SigmaAldrich	Z241547	8 mm pore size
Whatman Filter Paper Grade 541	SigmaAldrich	WHA1541055	22 mm pore size
Whatman Filter paper Grade 542	SigmaAldrich	WHA1542185	2.7 mm pore size
Wire Mesh Sieve	McMaster-Carr	9317T86	No. 100 Mesh