ייצור של מיקרוג'לים צ'יטוזן-גניפינים מבוקרי גודל ונטולי תחליב ליישומים של הנדסת רקמות

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה שאינה מבוססת על תחליב לייצור מיקרוגלים של צ’יטוזן-גניפין. ניתן לשלוט במדויק בגודלם של המיקרוג’לים האלה, והם יכולים להציג נפיחות תלוית pH, לפרק in vivo ולהיות עמוסים במולקולות טיפוליות שמשחררות לאורך זמן באופן מתמשך, מה שהופך אותם לרלוונטיים מאוד ליישומים של הנדסת רקמות.

Abstract

מיקרוגלים של Chitosan הם בעלי עניין משמעותי בהנדסת רקמות בשל מגוון רחב של יישומים, עלות נמוכה ואימונוגניות. עם זאת, מיקרוג’לים צ’יטוזן מיוצרים בדרך כלל בשיטות תחליב הדורשות שטיפות ממס אורגניות, שהן רעילות ומזיקות לסביבה. הפרוטוקול הנוכחי מציג שיטה מהירה, לא ציטוטוקסית, לא מבוססת תחליב, לייצור מיקרוג’לים צ’יטוזן-גניפין ללא צורך בשטיפות ממס אורגניות. ניתן לייצר את המיקרוג’לים המתוארים כאן עם בקרת גודל מדויקת. הם מציגים שחרור מתמשך של ביומולקולות, מה שהופך אותם לרלוונטיים מאוד להנדסת רקמות, ביו-חומרים ורפואה רגנרטיבית. Chitosan הוא crosslinked עם genipin כדי ליצור רשת הידרוג’ל, ולאחר מכן מועבר דרך מסנן מזרק כדי לייצר את microgels. ניתן לסנן את המיקרוג’לים כדי ליצור מגוון גדלים, והם מראים נפיחות תלוית pH ומתפרקים עם הזמן באופן אנזימטי. מיקרוג’לים אלה שימשו במודל פגיעה בלוחית גדילה של חולדה והודגמו כמעודדים תיקון מוגבר של רקמות הסחוס ומראים פירוק מלא לאחר 28 ימים in vivo. בשל העלות הנמוכה שלהם, הנוחות הגבוהה וקלות הייצור שלהם עם חומרים cytocompatible, מיקרוג’לים chitosan אלה מציגים טכנולוגיה מרגשת וייחודית בהנדסת רקמות.

Introduction

לוח הגדילה, הידוע גם בשם הפיזה, הוא מבנה הסחוס הממוקם בקצה העצמות הארוכות המתווך צמיחה אצל ילדים. אם צלחת הגדילה נפגעת, יכולה להיווצר רקמת תיקון המכונה “מוט גרמי”, אשר קוטעת את הצמיחה הרגילה ועלולה לגרום לפגמים בגדילה או לעיוותים זוויתיים. נתונים אפידמיולוגיים הראו כי 15%-30% מכלל פציעות השלד בילדות קשורות ללוחית הגדילה. היווצרות מוטות גרמיים מתרחשת בעד 30% מהפציעות הללו, מה שהופך את הפציעות של לוחות הגדילה והטיפול הקשור אליהן לבעיה משמעותית של ביטוי קליני 1,2,3,4. כאשר מתרחשת היווצרות מוטות גרמיים, שדרת הטיפול הנפוצה ביותר כוללת כריתה של המוט הגרמי והחדרת חומר אינטרפוזיציוני, כגון סיליקון או רקמת שומן⁵. עם זאת, לחולים שעוברים ניתוח כריתת בר גרמי יש לעתים קרובות פרוגנוזה גרועה להחלמה מלאה, שכן אין כיום טיפול שיכול לתקן באופן מלא לוחית גדילה פצועה ^6,7,8. לאור חסרונות אלה, קיים צורך קריטי באסטרטגיות יעילות לטיפול בפציעות של לוחות גדילה, הן במניעת היווצרות מוט גרמי והן בחידוש רקמת סחוס גופנית בריאה.

מיקרו-חלקיקי הידרוג’ל, או מיקרו-ג’לים, צברו לאחרונה עניין כפיגומים הניתנים להזרקה שיכולים לספק שחרור מתמשך של טיפולים⁹. בשל יכולת הכוונון הגבוהה וההתאמה הביולוגית שלהם, מיקרו-ג’לים מתאימים גם לגורם ביו-אקטיבי או לעטיפת תאים. מיקרוג’לים יכולים להיות עשויים מחומרים שונים, החל מפולימרים סינתטיים, כגון פוליאתילן גליקול (PEG), ועד פולימרים טבעיים כמו אלגינט או צ’יטוזן 10,11,12. הודגם כי לצ’יטוזן יש מספר השפעות מועילות על הנדסת רקמות, כגון יכולתו לערער את הממברנה החיצונית של חיידקים גראם שליליים, ובכך להציע פעילות אנטי-מיקרוביאלית מובנית^{1 3,14}. בנוסף, chitosan הוא חסכוני, אינטראקטיבי לתאים, ומשתנה בקלות באמצעות המבנה המכיל אמין שלו. מיקרוג’לים מבוססי צ’יטוזן מבטיחים אסטרטגיה חומרית ביולוגית להעברת תרופות ואיתות חומרים שיכולים לקדם התחדשות רקמות תוך מניעת זיהום חיידקי. עם זאת, מיקרוג’לים צ’יטוזן מיוצרים לעתים קרובות עם מגוון רחב של טכניקות הדורשות ציוד מיוחד, טכניקות תחליב או שטיפות ממסים ציטוטוקסיים. לדוגמה, מחקרים מסוימים יצרו מיקרו-ג’לים צ’יטוזן בשיטות מבוססות תחליב, אך פרוטוקולים אלה דורשים שטיפות ממסים והצלבות ציטוטוקסיות, מה שעלול לשלול את תרגומם להגדרות קליניות^15,16. מחקרים אחרים השתמשו בגישות מיקרופלואידיות או אלקטרוספריי כדי לייצר מיקרוג’לים של צ’יטוזן, הדורשים ציוד מיוחד, הכנה והכשרה^17,18. מיקרוגלים של צ’יטוזן מיוצרים בדרך כלל גם בתהליך טיפתי של קרוסלינקר לתמיסת צ’יטוזן; עם זאת, שיטה זו תלויה מאוד בצמיגות התמיסה, בריכוז הפולימרים ובקצב הזרימה, מה שמקשה על שליטה בגודל ובפיזור של המיקרוג’לים^19,20. לעומת זאת, השיטה לייצור מיקרוג’ל המתוארת כאן אינה דורשת ציוד מומחה או שטיפות ממסים, מה שהופך את המיקרוג’לים הללו לכדאיים לייצור כמעט בכל מעבדה או סביבה. לכן, מיקרוג’לים אלה מייצגים ביו-חומרים רלוונטיים ביותר עבור כלי מהיר, חסכוני וקל לייצור של תרופות עבור יישומים רבים.

על ידי ויסות הרכב המיקרוג’ל ומאפייני החומר, חוקרים יכולים להשיג שליטה מדויקת על המיקרו-סביבה התאית, ובכך לכוון את התנהגות התאים באופן התלוי בחומר. ניתן להשתמש במיקרוג’לים בכוחות עצמם או בשילוב עם מערכות חומר ביולוגי בתפזורת כדי להקנות פונקציות ספציפיות, כגון שחרור ממושך של גורמים ביו-אקטיביים או איתות מיוחד מדויק לתאים מקומיים או אקסוגניים. ביו-חומרים ומיקרו-ג’לים התגלו כאפיקי טיפול אטרקטיביים לפציעות בלוחות גדילה. מאמץ משמעותי הוקדש לפיתוח ביו-חומרים מבוססי אלגינט וצ’יטוזן לטיפול בפציעות של לוחות גדילה 21,22,23,24,25. בשל האופי הזמני הדינמי של אוסיפיקציה של צלחת גדילה והתארכות עצם, המנגנון של היווצרות מוטות גרמי אינו מובן במלואו. לכן, פותחו מספר מודלים של בעלי חיים כדי להבהיר טוב יותר את המנגנונים של אוסיפיקציה אנדוכונדרלית והיווצרות מוטות גרמיים, כגון בחולדות, ארנבות וכבשים 26,27,28. מודל אחד כזה הוא מודל פגיעה בלוחית גדילה של חולדה, המשתמש בפגם חור מקדחה בשוקת החולדה כדי לייצר מוט גרמי באופן צפוי וניתן לשחזור ומחקה פציעות אנושיות בכל שלושת האזורים של לוחית הגדילה^29,30. מספר אסטרטגיות מבוססות חומר ביולוגי לטיפול בפציעות של לוחות גדילה נבדקו באמצעות מודל זה. בנוסף, פותחו שתי שיטות שונות לייצור מיקרוגלים צ’יטוזן, שיכולות לשמש כמערכת חומרית ביולוגית הניתנת להזרקה המשחררת טיפולים באופן מתמשך^10,31. מיקרו-ג’לים אלה הוכנסו למודל של פגיעה גופנית בחולדה, והם הראו שיפור בהתחדשות^{הסחוס 31} בעת שחרור SDF-1a ו-TGF-b3. הטכניקות המסופקות בפרוטוקול זה מתארות שיטות שפותחו לייצור מיקרו-ג’לים צ’יטוזן אלה, אשר לאחר מכן ניתן להשתמש בהם במגוון רחב של יישומים להנדסת רקמות. לדוגמה, מחקרים אחרונים השתמשו במיקרוגלים של צ’יטוזן המגיבים לתרמו או מג’נטו עבור יישומי אספקת תרופות אונקולוגיות מבוקרות^32,33.

Protocol

כל ההליכים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת קולורדו דנבר. במחקר הנוכחי נעשה שימוש בחולדות ספראג-דאולי זכרות בנות 6 שבועות. מודל הפגיעה בלוחית הגדילה של החולדה נוצר בעקבות דו”ח30 שפורסם בעבר. 1. הכנת פולימר הצ’יטוזן</str…

Representative Results

ייצור מוצלח של מיקרוגלים צ’יטוזן מסתמך על תגובת ההצלבה בין גניפין לצ’יטוזן, במיוחד המערבת את האמינים בשרשראות הפולימרים של הצ’יטוזן. בניגוד לטכניקות אחרות לייצור מיקרוג’ל, שיטה זו אינה דורשת תחליבים או שטיפות ממסים וניתן לבצע אותה במהירות ובקלות עם ציוד זול. סימן היכר לייצור מוצלח של מיקרו…

Discussion

מיקרוג’לים נחקרו באופן נרחב בשנים האחרונות בשל רמת הישימות הגבוהה שלהם למטרות שונות, כגון אספקת תרופות או אנקפסולציה של תאים⁹. קלות הייצור של מבנים ביו-חומריים בקנה מידה זעיר היא בעלת רלוונטיות משמעותית בהנדסת רקמות, מכיוון שהיא מאפשרת לחוקרים לפתח אסטרטגיות מבוססות הידרוג’ל…

Materials

Acetic acid	SigmaAldrich	AX0073
BD Luer-Lock Syringe	Fisher Scientific	14-823-16E
Büchner Funnel	Fisher Scientific	FB966F	100 mm diameter
Chitosan (low molecular weight)	SigmaAldrich	448869	75-80% deacetylation
Dialysis Membrane Tubing	Fisher Scientific	08-670-5C	3500 MWCO
Ethanol	SigmaAldrich	493538
Genipin	SigmaAldrich	G4796
Heracell 150i Incubator	ThermoFisher	50116047
Parafilm	Fisher Scientific	13-374-12
Recombinant human SDF-1a	Peprotech	300-28A
Recombinant human TGF-b3	Peprotech	100-36E
Whatman Filter Paper Grade 540	SigmaAldrich	Z241547	8 mm pore size
Whatman Filter Paper Grade 541	SigmaAldrich	WHA1541055	22 mm pore size
Whatman Filter paper Grade 542	SigmaAldrich	WHA1542185	2.7 mm pore size
Wire Mesh Sieve	McMaster-Carr	9317T86	No. 100 Mesh