Den nåværende protokollen beskriver en ikke-emulsjonsbasert metode for fabrikasjon av chitosan-genipin mikrogeler. Størrelsen på disse mikrogelene kan kontrolleres nøyaktig, og de kan vise pH-avhengig hevelse, forringe in vivo og være lastet med terapeutiske molekyler som frigjøres over tid på en vedvarende måte, noe som gjør dem svært relevante for vevsteknikk.
Chitosan mikrogeler er av betydelig interesse for vevsteknikk på grunn av deres brede spekter av applikasjoner, lav pris og immunogenisitet. Imidlertid fremstilles chitosanmikrogeler ofte ved hjelp av emulsjonsmetoder som krever organiske løsningsmiddelskyllinger, som er giftige og skadelige for miljøet. Den nåværende protokollen presenterer en rask, ikke-cytotoksisk, ikke-emulsjonsbasert metode for fremstilling av chitosan-genipinmikrogeler uten behov for organiske løsningsmiddelskyllinger. Mikrogelene som er beskrevet her, kan fremstilles med presis størrelseskontroll. De viser vedvarende frigjøring av biomolekyler, noe som gjør dem svært relevante for vevsteknikk, biomaterialer og regenerativ medisin. Chitosan er krysskoblet med genipin for å danne et hydrogelnettverk, og passerer deretter gjennom et sprøytefilter for å produsere mikrogelene. Mikrogelene kan filtreres for å skape en rekke størrelser, og de viser pH-avhengig hevelse og nedbrytning over tid enzymatisk. Disse mikrogelene har vært ansatt i en rottevekstplateskademodell og ble demonstrert for å fremme økt bruskvevsreparasjon og for å vise fullstendig nedbrytning ved 28 dager in vivo. På grunn av deres lave kostnader, høy bekvemmelighet og enkel fabrikasjon med cytokompatible materialer, presenterer disse chitosan mikrogelene en spennende og unik teknologi innen vevsteknikk.
Vekstplaten, også kjent som fysen, er bruskstrukturen som ligger på slutten av lange bein som formidler vekst hos barn. Hvis vekstplaten blir skadet, kan reparasjonsvev kjent som en “benaktig bar” dannes, noe som avbryter normal vekst og kan forårsake vekstfeil eller vinkeldeformiteter. Epidemiologiske data har vist at 15% -30% av alle barndoms skjelettskader er relatert til vekstplaten. Benete bardannelse forekommer i opptil 30% av disse skadene, noe som gjør vekstplateskader og deres tilhørende behandling til et betydelig klinisk manifestasjonsproblem 1,2,3,4. Når benete bardannelse oppstår, innebærer den vanligste behandlingsgaten å reseksjon av benete bar og sette inn et interposisjonelt materiale, for eksempel silisium eller fettvev5. Imidlertid har pasienter som gjennomgår benete bar reseksjonskirurgi ofte en dårlig prognose for full gjenoppretting, da det for tiden ikke er noen behandling som fullt ut kan reparere en skadet vekstplate 6,7,8. I lys av disse manglene er det et kritisk behov for effektive strategier for behandling av vekstplateskader, både for å forhindre dannelse av en benaktig bar og regenerere sunt fysealt bruskvev.
Hydrogel-mikropartikler, eller mikrogeler, har nylig fått interesse som injiserbare stillaser som kan gi vedvarende frigjøring av terapeutiskestoffer 9. På grunn av deres høye tunabilitet og biokompatibilitet er mikrogeler også godt egnet for bioaktiv faktor eller celleinnkapsling. Mikrogeler kan være laget av ulike materialer, alt fra syntetiske polymerer, for eksempel polyetylenglykol (PEG), til naturlige polymerer som alginat eller chitosan 10,11,12. Chitosan har vist seg å ha flere gunstige effekter for vevsteknikk, for eksempel dens evne til å destabilisere den ytre membranen av gram-negative bakterier, og dermed tilby iboende antimikrobiell aktivitet1 3,14. I tillegg er chitosan kostnadseffektiv, celle-interaktiv og enkelt modifisert ved hjelp av sin aminholdige struktur. Chitosan-baserte mikrogeler lover en biomaterialestrategi for legemiddellevering og materialsignalering som kan fremme vevregenerering samtidig som bakteriell infeksjon forhindres. Imidlertid er chitosanmikrogeler ofte fremstilt med et bredt spekter av teknikker som krever spesialutstyr, emulsjonsteknikker eller cytotoksiske løsningsmiddelskyllinger. For eksempel har noen studier fabrikkert chitosanmikrogeler med emulsjonsbaserte metoder, men disse protokollene krever løsningsmiddelskylling og cytotoksiske krysskoblinger, noe som potensielt negerer oversettelsen til kliniske innstillinger15,16. Andre studier har brukt mikrofluidikk eller elektrospray tilnærminger for å fremstille chitosan mikrogeler, som krever spesialutstyr, forberedelse og trening17,18. Chitosan mikrogeler er også ofte laget med en dråpevis prosess med crosslinker i chitosan løsning; Denne metoden er imidlertid svært avhengig av løsningsviskositet, polymerkonsentrasjon og strømningshastighet, noe som gjør det vanskelig å kontrollere størrelsen og dispergeringen av mikrogelene19,20. Omvendt krever metoden for mikrogelproduksjon beskrevet heri ikke noe spesialutstyr eller løsningsmiddelskylling, noe som gjør disse mikrogelene levedyktige for fabrikasjon i nesten alle laboratorier eller omgivelser. Derfor representerer disse mikrogelene svært relevante biomaterialer for et raskt, kostnadseffektivt og lett å produsere legemiddelleveringskjøretøy for mange bruksområder.
Ved å modulere en mikrogels sammensetning og materielle egenskaper, kan forskere få presis kontroll over det cellulære mikromiljøet, og dermed lede celleadferd på en materialavhengig måte. Mikrogeler kan brukes på egen hånd eller kombineres med bulk biomaterialer for å gi spesifikke funksjoner, for eksempel utvidet frigjøring av bioaktive faktorer eller presis spesiell signalering for innfødte eller eksogene celler. Biomaterialer og mikrogeler har dukket opp som attraktive behandlingsveier for vekstplateskader. Betydelig innsats har vært dedikert til å utvikle alginat- og chitosanbaserte biomaterialer for å behandle vekstplateskader 21,22,23,24,25. På grunn av den dynamiske temporale naturen til vekstplate ossifikasjon og benforlengelse, er mekanismen for benaktig bardannelse ikke fullt ut forstått. Derfor er flere dyremodeller utviklet for bedre å belyse mekanismene for endokondriell ossifikasjon og benete bardannelse, som hos rotter, kaniner og sauer 26,27,28. En slik modell er en rottevekstplateskademodell, som bruker en borehullsfeil i rottetibia for å produsere en benaktig bar på en forutsigbar og reproduserbar måte og etterligner menneskelige skader på tvers av alle tre sonene i vekstplaten29,30. Flere biomaterialebaserte strategier for behandling av vekstplateskader er testet med denne modellen. I tillegg er det utviklet to forskjellige metoder for fremstilling av chitosanmikrogeler, som kan brukes som et injiserbart biomaterialesystem som frigjør terapeutiske midler på en vedvarende måte 10,31. Disse mikrogelene har vært ansatt i en rottefyseal skademodell, og de viste forbedret bruskregenerering31 når de slapp SDF-1a og TGF-b3. Teknikkene i denne protokollen beskriver metoder utviklet for å fremstille disse chitosan mikrogelene, som deretter kan brukes i et bredt spekter av vevsteknikkapplikasjoner. For eksempel har nyere studier brukt termo- eller magento-responsive chitosanmikrogeler for kontrollerte onkologiske legemiddelleveringsapplikasjoner32,33.
Mikrogeler har blitt mye undersøkt de siste årene på grunn av deres høye anvendbarhet for ulike formål, for eksempel legemiddellevering eller celleinnkapsling9. Enkel produksjon av mikroskala biomaterialer er av betydelig relevans i vevsteknikk, da det gjør det mulig for forskere å utvikle hydrogelbaserte strategier i en bestemt størrelse og tidsskala. Imidlertid krever de fleste metoder for fremstilling av chitosanmikrogeler dyrt utstyr og reagenser, emulsjoner eller cytotoksiske løsning…
The authors have nothing to disclose.
Forskning rapportert i denne publikasjonen ble støttet av National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases of the National Institute of Health under tildelingsnummer R03AR068087 og R21AR071585 og av Boettcher Foundation (#11219) til MDK. CBE ble støttet av NIH/NCATS Colorado CTSA Grant Number TL1 TR001081.
Acetic acid | SigmaAldrich | AX0073 | |
BD Luer-Lock Syringe | Fisher Scientific | 14-823-16E | |
Büchner Funnel | Fisher Scientific | FB966F | 100 mm diameter |
Chitosan (low molecular weight) | SigmaAldrich | 448869 | 75-80% deacetylation |
Dialysis Membrane Tubing | Fisher Scientific | 08-670-5C | 3500 MWCO |
Ethanol | SigmaAldrich | 493538 | |
Genipin | SigmaAldrich | G4796 | |
Heracell 150i Incubator | ThermoFisher | 50116047 | |
Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-12 | |
Recombinant human SDF-1a | Peprotech | 300-28A | |
Recombinant human TGF-b3 | Peprotech | 100-36E | |
Whatman Filter Paper Grade 540 | SigmaAldrich | Z241547 | 8 mm pore size |
Whatman Filter Paper Grade 541 | SigmaAldrich | WHA1541055 | 22 mm pore size |
Whatman Filter paper Grade 542 | SigmaAldrich | WHA1542185 | 2.7 mm pore size |
Wire Mesh Sieve | McMaster-Carr | 9317T86 | No. 100 Mesh |