Fabrikasjon av størrelseskontrollerte og emulsjonsfrie Chitosan-Genipin-mikrogeler for vevsteknikkapplikasjoner

Summary

Den nåværende protokollen beskriver en ikke-emulsjonsbasert metode for fabrikasjon av chitosan-genipin mikrogeler. Størrelsen på disse mikrogelene kan kontrolleres nøyaktig, og de kan vise pH-avhengig hevelse, forringe in vivo og være lastet med terapeutiske molekyler som frigjøres over tid på en vedvarende måte, noe som gjør dem svært relevante for vevsteknikk.

Abstract

Chitosan mikrogeler er av betydelig interesse for vevsteknikk på grunn av deres brede spekter av applikasjoner, lav pris og immunogenisitet. Imidlertid fremstilles chitosanmikrogeler ofte ved hjelp av emulsjonsmetoder som krever organiske løsningsmiddelskyllinger, som er giftige og skadelige for miljøet. Den nåværende protokollen presenterer en rask, ikke-cytotoksisk, ikke-emulsjonsbasert metode for fremstilling av chitosan-genipinmikrogeler uten behov for organiske løsningsmiddelskyllinger. Mikrogelene som er beskrevet her, kan fremstilles med presis størrelseskontroll. De viser vedvarende frigjøring av biomolekyler, noe som gjør dem svært relevante for vevsteknikk, biomaterialer og regenerativ medisin. Chitosan er krysskoblet med genipin for å danne et hydrogelnettverk, og passerer deretter gjennom et sprøytefilter for å produsere mikrogelene. Mikrogelene kan filtreres for å skape en rekke størrelser, og de viser pH-avhengig hevelse og nedbrytning over tid enzymatisk. Disse mikrogelene har vært ansatt i en rottevekstplateskademodell og ble demonstrert for å fremme økt bruskvevsreparasjon og for å vise fullstendig nedbrytning ved 28 dager in vivo. På grunn av deres lave kostnader, høy bekvemmelighet og enkel fabrikasjon med cytokompatible materialer, presenterer disse chitosan mikrogelene en spennende og unik teknologi innen vevsteknikk.

Introduction

Vekstplaten, også kjent som fysen, er bruskstrukturen som ligger på slutten av lange bein som formidler vekst hos barn. Hvis vekstplaten blir skadet, kan reparasjonsvev kjent som en “benaktig bar” dannes, noe som avbryter normal vekst og kan forårsake vekstfeil eller vinkeldeformiteter. Epidemiologiske data har vist at 15% -30% av alle barndoms skjelettskader er relatert til vekstplaten. Benete bardannelse forekommer i opptil 30% av disse skadene, noe som gjør vekstplateskader og deres tilhørende behandling til et betydelig klinisk manifestasjonsproblem 1,2,3,4. Når benete bardannelse oppstår, innebærer den vanligste behandlingsgaten å reseksjon av benete bar og sette inn et interposisjonelt materiale, for eksempel silisium eller fettvev⁵. Imidlertid har pasienter som gjennomgår benete bar reseksjonskirurgi ofte en dårlig prognose for full gjenoppretting, da det for tiden ikke er noen behandling som fullt ut kan reparere en skadet vekstplate ^6,7,8. I lys av disse manglene er det et kritisk behov for effektive strategier for behandling av vekstplateskader, både for å forhindre dannelse av en benaktig bar og regenerere sunt fysealt bruskvev.

Hydrogel-mikropartikler, eller mikrogeler, har nylig fått interesse som injiserbare stillaser som kan gi vedvarende frigjøring av terapeutiske^{stoffer 9}. På grunn av deres høye tunabilitet og biokompatibilitet er mikrogeler også godt egnet for bioaktiv faktor eller celleinnkapsling. Mikrogeler kan være laget av ulike materialer, alt fra syntetiske polymerer, for eksempel polyetylenglykol (PEG), til naturlige polymerer som alginat eller chitosan 10,11,12. Chitosan har vist seg å ha flere gunstige effekter for vevsteknikk, for eksempel dens evne til å destabilisere den ytre membranen av gram-negative bakterier, og dermed tilby iboende antimikrobiell aktivitet^{1 3,14}. I tillegg er chitosan kostnadseffektiv, celle-interaktiv og enkelt modifisert ved hjelp av sin aminholdige struktur. Chitosan-baserte mikrogeler lover en biomaterialestrategi for legemiddellevering og materialsignalering som kan fremme vevregenerering samtidig som bakteriell infeksjon forhindres. Imidlertid er chitosanmikrogeler ofte fremstilt med et bredt spekter av teknikker som krever spesialutstyr, emulsjonsteknikker eller cytotoksiske løsningsmiddelskyllinger. For eksempel har noen studier fabrikkert chitosanmikrogeler med emulsjonsbaserte metoder, men disse protokollene krever løsningsmiddelskylling og cytotoksiske krysskoblinger, noe som potensielt negerer oversettelsen til kliniske innstillinger^15,16. Andre studier har brukt mikrofluidikk eller elektrospray tilnærminger for å fremstille chitosan mikrogeler, som krever spesialutstyr, forberedelse og trening^17,18. Chitosan mikrogeler er også ofte laget med en dråpevis prosess med crosslinker i chitosan løsning; Denne metoden er imidlertid svært avhengig av løsningsviskositet, polymerkonsentrasjon og strømningshastighet, noe som gjør det vanskelig å kontrollere størrelsen og dispergeringen av mikrogelene^19,20. Omvendt krever metoden for mikrogelproduksjon beskrevet heri ikke noe spesialutstyr eller løsningsmiddelskylling, noe som gjør disse mikrogelene levedyktige for fabrikasjon i nesten alle laboratorier eller omgivelser. Derfor representerer disse mikrogelene svært relevante biomaterialer for et raskt, kostnadseffektivt og lett å produsere legemiddelleveringskjøretøy for mange bruksområder.

Ved å modulere en mikrogels sammensetning og materielle egenskaper, kan forskere få presis kontroll over det cellulære mikromiljøet, og dermed lede celleadferd på en materialavhengig måte. Mikrogeler kan brukes på egen hånd eller kombineres med bulk biomaterialer for å gi spesifikke funksjoner, for eksempel utvidet frigjøring av bioaktive faktorer eller presis spesiell signalering for innfødte eller eksogene celler. Biomaterialer og mikrogeler har dukket opp som attraktive behandlingsveier for vekstplateskader. Betydelig innsats har vært dedikert til å utvikle alginat- og chitosanbaserte biomaterialer for å behandle vekstplateskader 21,22,23,24,25. På grunn av den dynamiske temporale naturen til vekstplate ossifikasjon og benforlengelse, er mekanismen for benaktig bardannelse ikke fullt ut forstått. Derfor er flere dyremodeller utviklet for bedre å belyse mekanismene for endokondriell ossifikasjon og benete bardannelse, som hos rotter, kaniner og sauer 26,27,28. En slik modell er en rottevekstplateskademodell, som bruker en borehullsfeil i rottetibia for å produsere en benaktig bar på en forutsigbar og reproduserbar måte og etterligner menneskelige skader på tvers av alle tre sonene i vekstplaten^29,30. Flere biomaterialebaserte strategier for behandling av vekstplateskader er testet med denne modellen. I tillegg er det utviklet to forskjellige metoder for fremstilling av chitosanmikrogeler, som kan brukes som et injiserbart biomaterialesystem som frigjør terapeutiske midler på en vedvarende måte ^10,31. Disse mikrogelene har vært ansatt i en rottefyseal skademodell, og de viste forbedret bruskregenerering³¹ når de slapp SDF-1a og TGF-b3. Teknikkene i denne protokollen beskriver metoder utviklet for å fremstille disse chitosan mikrogelene, som deretter kan brukes i et bredt spekter av vevsteknikkapplikasjoner. For eksempel har nyere studier brukt termo- eller magento-responsive chitosanmikrogeler for kontrollerte onkologiske legemiddelleveringsapplikasjoner^32,33.

Protocol

Alle dyreprosedyrer ble godkjent av University of Colorado Denver Institutional Animal Care and Use Committee. 6 uker gamle mannlige Sprague-Dawley rotter ble brukt til den nåværende studien. Rottevekstplateskademodellen ble opprettet etter en tidligere publisert rapport30. 1. Fremstilling av chitosanpolymeren Få renset og lyofilisert lavmolekylær (LMW) chitosan fra kommersielt tilgjengelige kilder (se Materialfortegnelser…

Representative Results

Vellykket fabrikasjon av chitosan mikrogeler er avhengig av krysskoblingsreaksjonen mellom genipin og chitosan, spesielt involverer aminer på chitosan polymerkjeder. I motsetning til andre mikrogel fabrikasjonsteknikker krever denne metoden ikke emulsjoner eller løsningsmiddelskylling og kan raskt og enkelt utføres med billig utstyr. En kjennetegnindikator for vellykket mikrogelproduksjon er den distinkte fargeendringen fra off-white til mørkeblå etter at chitosan og genipin har blitt blandet. Den krysskoblede reaks…

Discussion

Mikrogeler har blitt mye undersøkt de siste årene på grunn av deres høye anvendbarhet for ulike formål, for eksempel legemiddellevering eller celleinnkapsling⁹. Enkel produksjon av mikroskala biomaterialer er av betydelig relevans i vevsteknikk, da det gjør det mulig for forskere å utvikle hydrogelbaserte strategier i en bestemt størrelse og tidsskala. Imidlertid krever de fleste metoder for fremstilling av chitosanmikrogeler dyrt utstyr og reagenser, emulsjoner eller cytotoksiske løsning…

Materials

Acetic acid	SigmaAldrich	AX0073
BD Luer-Lock Syringe	Fisher Scientific	14-823-16E
Büchner Funnel	Fisher Scientific	FB966F	100 mm diameter
Chitosan (low molecular weight)	SigmaAldrich	448869	75-80% deacetylation
Dialysis Membrane Tubing	Fisher Scientific	08-670-5C	3500 MWCO
Ethanol	SigmaAldrich	493538
Genipin	SigmaAldrich	G4796
Heracell 150i Incubator	ThermoFisher	50116047
Parafilm	Fisher Scientific	13-374-12
Recombinant human SDF-1a	Peprotech	300-28A
Recombinant human TGF-b3	Peprotech	100-36E
Whatman Filter Paper Grade 540	SigmaAldrich	Z241547	8 mm pore size
Whatman Filter Paper Grade 541	SigmaAldrich	WHA1541055	22 mm pore size
Whatman Filter paper Grade 542	SigmaAldrich	WHA1542185	2.7 mm pore size
Wire Mesh Sieve	McMaster-Carr	9317T86	No. 100 Mesh