Der Caco-2-Zell-Bioassay zur Messung der Eisenbioverfügbarkeit von Lebensmitteln
Summary
Der Caco-2-Zell-Bioassay für die Bioverfügbarkeit von Eisen (Fe) stellt einen kostengünstigen und vielseitigen Ansatz zur Beurteilung der Fe-Bioverfügbarkeit von Lebensmitteln, Lebensmittelprodukten, Nahrungsergänzungsmitteln, Mahlzeiten und sogar Diäten dar. Es wurde gründlich für Humanstudien validiert und stellt den Stand der Technik für Studien zur Fe-Bioverfügbarkeit dar.
Abstract
Das Wissen über die Bioverfügbarkeit von Fe ist entscheidend für die Beurteilung der Ernährungsqualität von Fe in Lebensmitteln. Die In-vivo-Messung der Fe-Bioverfügbarkeit ist durch Kosten, Durchsatz und die Vorbehalte begrenzt, die der Isotopenmarkierung des Lebensmittels Fe innewohnen. Daher besteht ein kritischer Bedarf an einem Ansatz, der mit hohem Durchsatz und kostengünstig ist. Der Caco-2-Zellbioassay wurde entwickelt, um diesen Bedarf zu decken. Der Caco-2-Zell-Bioassay für die Fe-Bioverfügbarkeit verwendet eine simulierte Magen- und Darmverdauung in Verbindung mit der Kultur einer menschlichen Darmepithelzelllinie, die als Caco-2 bekannt ist. In Caco-2-Zellen stimuliert die Fe-Aufnahme die intrazelluläre Bildung von Ferritin, einem Fe-Speicherprotein, das leicht mit einem Enzym-gebundenen Immunassay (ELISA) gemessen werden kann. Ferritin bildet sich proportional zur Fe-Aufnahme; So kann man durch die Messung der Caco-2-Zellferritinproduktion die intestinale Fe-Aufnahme aus simulierten Nahrungsverdauungen in die Enterozyten beurteilen.
Über diesen Ansatz repliziert das Modell den wichtigsten ersten Schritt, der die Bioverfügbarkeit von Lebensmittel-Fe bestimmt. Seit seiner Einführung im Jahr 1998 wurde dieser Modellansatz rigoros mit Faktoren verglichen, von denen bekannt ist, dass sie die menschliche Fe-Bioverfügbarkeit beeinflussen. Darüber hinaus wurde es in parallelen Studien angewendet, wobei drei Wirksamkeitsstudien am Menschen biofortifizierte Fe-Pflanzen bewerteten. In allen Fällen sagte der Bioassay die relativen Mengen an Fe-Bioverfügbarkeit aus den Faktoren, den Kulturen und der Gesamternährung korrekt voraus. Dieser Artikel enthält detaillierte Methoden zur Caco-2-Zellkultur in Verbindung mit dem In-vitro-Verdauungsprozess und dem Zellferritin-ELISA, der für die Durchführung des Caco-2-Zell-Bioassays für die Fe-Bioverfügbarkeit erforderlich ist.
Introduction
Um den Forschungsbedarf und Nutzen des Caco-2-Zell-Bioassays für die Fe-Bioverfügbarkeit vollständig zu verstehen, müssen zunächst die Ansätze verstanden werden, die vor dem Aufkommen dieses Modells vorhanden waren. Die Messung der Fe-Bioverfügbarkeit aus einem Lebensmittel oder einer Mahlzeit in vivo ist eine anspruchsvolle Aufgabe, insbesondere wenn Kombinationen von Lebensmitteln in einer Mahlzeit oder Diät bewertet werden müssen. Die Isotopenmarkierung war in den letzten 50 Jahren der gebräuchlichste Ansatz zur Messung der Fe-Bioverfügbarkeit1. Die Isotopenmarkierung wird für Einzelmahlzeiten- und Mehrmahlzeitenstudien verwendet und ist für Langzeitstudien unpraktisch. Stabile Isotope von Fe wie 57Fe und 58Fe werden am häufigsten verwendet; Es wurden jedoch Studien mit Radioisotopen wie 59Fe durchgeführt, wobei die Ganzkörperzählung verwendet wurde2. Für pflanzliche Lebensmittel wurde die Isotopenmarkierung über extrinsische oder intrinsische Markierung durchgeführt. Für die extrinsische Markierung wird dem Lebensmittel oder der Mahlzeit eine bekannte Menge an Isotop zugesetzt. Das Essen wird dann gemischt und eine 15-30-minütige Äquilibrierungsperiode wird vor dem Verzehr in das Protokoll aufgenommen. Hydroponische Kultur – Hinzufügen des Isotops zur Nährlösung, um es in die Pflanze einzubauen, während sie wächst und sich entwickelt – ist für die intrinsische Kennzeichnung von pflanzlichen Lebensmitteln erforderlich. Die Vor- und Nachteile der einzelnen Ansätze werden im Folgenden erörtert.
Extrinsische Isotopenmarkierung
In den frühen bis mittleren 1970er Jahren wurde die menschliche Fe-Absorption durch extrinsische Markierung von Fe in Lebensmitteln untersucht, wobei eine bekannte Menge an Isotop zu der bekannten Menge an Fe in der Nahrung oder Mahlzeit hinzugefügt, gemischt und für 15-30 min vor den Messungen ausgeglichen wird. Es wurden verschiedene Mengen extrinsischer Isotope verwendet, die von 1% bis 100% des intrinsischen Fe reichen, aber am häufigsten im Bereich von 7% -30%3. Die extrinsische Markierung basiert auf der Annahme, dass das extrinsische Fe-Isotop vollständig mit dem intrinsischen Fe des Lebensmittels oder der Mahlzeit ausgeglichen wird. Die extrinsische Isotopenabsorption wird dann gemessen, und jedes Atom des extrinsischen Isotops wird berechnet, um eine bestimmte Anzahl von intrinsischen Fe-Atomen darzustellen. Diese Berechnung basiert auf den relativen molaren Mengen. Im Jahr 1983 wurden mehrere Validierungsstudien der Technik in einem Übersichtspapier4 zusammengefasst. Die Validierung der Technik erfolgte durch gleichzeitigen Vergleich der prozentualen Absorption der extrinsischen Isotopenmarkierung mit der prozentualen Absorption einer intrinsischen Isotopenmarkierung. Somit deutet ein Verhältnis der extrinsischen zur intrinsischen Absorption nahe 1 darauf hin, dass jeder Fe-Pool gleichmäßig absorbiert wurde. Zu dieser Zeit wurde ein Verhältnis nahe 1 auch als Gleichgewicht des extrinsischen Isotops mit dem intrinsischen Fe des Lebensmittels oder der Mahlzeit angesehen. Das Verhältnis von extrinsischer zu intrinsischer Fe-Absorption reichte von Mittelwerten von 0,40 bis 1,62, mit einem mittleren (±SD) Verhältnis von 1,08 ± 0,14 in 63 Vergleichen. Es ist wichtig anzumerken, dass in allen in diesem Review zusammengefassten Studien keine direkt das Gleichgewicht der extrinsischen Markierung mit dem intrinsischen Fe getestet hat. Zusammenfassend kamen die Autoren des Reviews zu folgendem Schluss:
“Die extrinsische Tag-Technik hat sich für mehrere Lebensmittel unter bestimmten experimentellen Bedingungen bewährt. Diese Methode kann jedoch noch nicht in Bezug auf alle Arten von Lebensmitteln als bewährt angesehen werden. Die extrinsische Tag-Methode ist nicht geeignet, um die Eisenaufnahme aus einer Diät zu überwachen, die unlösliche Formen von Eisen enthält. Die Gültigkeit dieser Technik beruht auf der Grundannahme, dass der extrinsische Tag vollständig mit allen endogenen Nicht-Häm-Lebensmitteln austauscht. Derzeit ist nicht bekannt, wie vollständig die verschiedenen Formen von Nichthämeisen durch ein extrinsisches Etikett gekennzeichnet sind. Dies ist wichtig angesichts von Studien, die darauf hindeuten, dass Eiseninhibitoren die extrinsische Markierung anders beeinflussen können als einige Formen von Nicht-Häm-Eisen in Lebensmitteln. Die Erforschung von Lebensmittelfaktoren, die einen vollständigen Isotopenaustausch beeinträchtigen können, ist spärlich. Daher erfordert die Interpretation von Bioverfügbarkeitsdaten aus der extrinsischen Tag-Forschung die Berücksichtigung von Austauschinhibitoren, die in der Nahrung oder Ernährung vorhanden sein können. “
Seit 1983 wurden nur zwei Studien veröffentlicht, die die Genauigkeit der extrinsischen Markierung von Fe 3,5 untersuchten. In beiden Studien wurde das Gleichgewicht einer extrinsischen Isotopenmarkierung direkt mit dem intrinsischen Fe der Lebensmittel verglichen, die in diesen Studien Grundnahrungsmittel waren. Getestet wurden weiße, rote und schwarze Bohnensorten sowie Linsen und Mais. Unter Verwendung etablierter In-vitro-Aufschlusstechniken und der Messung der Fe-Löslichkeit und -Fällung zeigten beide Studien, dass die extrinsische Isotopenmarkierung nicht konsistent zu einem vollständigen Gleichgewicht führt, mit dem Hinweis, dass bei einigen Bohnensorten das Ungleichgewicht in Abhängigkeit von der Menge des extrinsischen Isotops und der Farbe der Samenhülle sehr hoch sein kann3. Trotz der Schlußfolgerungen der Übersichtsarbeit von 1983 wurden die extrinsischen Kennzeichnungsstudien von Bohnen fortgesetzt 6,7,8,9,10,11,12. Keine dieser Studien beinhaltete das Testen des Gleichgewichts der extrinsischen Markierung mit dem intrinsischen Fe.
Intrinsische Markierung
Die intrinsische Markierung von Pflanzennahrung zur Beurteilung der Fe-Bioverfügbarkeit eliminiert die Genauigkeitsprobleme des Gleichgewichts bei der extrinsischen Markierung. Dieser Ansatz kann jedoch keine großen Mengen an Material liefern, da Gewächshausfläche für die hydroponische Kultur benötigt wird. Hydroponische Kultur ist arbeitsintensiv, erfordert eine hohe Menge an teuren stabilen Isotopen und führt oft zu einem Pflanzenwachstum, das sich in Bezug auf Ertrag und Samen-Fe-Konzentration unterscheidet. Aufgrund der Kosten eignet sich die intrinsische Kennzeichnung nur für kleine Studien, die darauf abzielen, die Mechanismen zu verstehen, die der Fe-Aufnahme zugrunde liegen, oder Faktoren, die die Fe-Aufnahme aus Lebensmitteln beeinflussen. Die Produktion von 1-2 kg eines Grundnahrungsmittels kostet allein für Materialien etwa 20.000 bis 30.000 US-Dollar, abhängig vom isotopischen und hydroponischen Ansatz13,14.
Angesichts der Herausforderungen, die mit der Isotopenmarkierung verbunden sind, versuchten die Forscher, In-vitro-Ansätze zu entwickeln. Frühe Methoden verwendeten simulierte Magen- und Darmnahrung, gekoppelt mit der Messung der Fe-Löslichkeit oder Fe-Dialysierbarkeit als Schätzung der Bioverfügbarkeit15. Solche Studien fanden schnell heraus, dass die Fe-Dialysierbarkeit kein konsistentes Maß für die Bioverfügbarkeit war, da Fe löslich, eng an Verbindungen gebunden und daher nicht austauschbar sein kann, was zu einer Überschätzung der Bioverfügbarkeit führt. Um diese Probleme anzugehen, entwickelte sich eine Methodik zur Nutzung einer menschlichen Darmzelllinie, wodurch eine lebende Komponente hinzugefügt wurde und die Messung der Fe-Aufnahme ermöglichtwurde 16. Die menschlichen Darmzellen – Caco-2-Zellen – stammen aus einem menschlichen Kolonkarzinom und wurden häufig in Nährstoffaufnahmestudien verwendet. Diese Zelllinie ist nützlich, da sich die Zellen in Kultur in Enterozyten differenzieren, die ähnlich wie die Bürstenrandzellen des Dünndarms funktionieren. Studien haben gezeigt, dass Caco-2-Zellen die entsprechenden Transporter und Reaktionen auf Faktoren zeigen, die die Fe-Aufnahme beeinflussen17,18.
Die ersten Studien, die Radioisotope zur Messung der Fe-Aufnahme in Caco-2-Zellen verwendeten, wurden verfeinert, um die Fe-Aufnahme basierend auf der Caco-2-Zellferritinbildung zu messen. Die Messung von Caco-2-Zellferritin verbesserte den Probendurchsatz und beseitigte Probleme der Radioisotopenhandhabung und des Gleichgewichts von extrinsischem Fe mit intrinsischem Fe 19,20. Die Messung der Fe-Aufnahme über die Ferritinbildung ermöglichte es den Forschern, eine breite Palette von Lebensmitteln zu untersuchen, einschließlich komplexer Mahlzeiten21. So lieferte die simulierte (in vitro) Verdauung in Verbindung mit der Fe-Aufnahme von Caco-2-Zellen eine bessere physiologische Beurteilung der Fe-Aufnahme aus der Nahrung. Es ist wichtig zu beachten, dass dieses Modell in erster Linie relative Unterschiede in der Fe-Bioverfügbarkeit bestimmt. Wie viele nützliche Zelllinien haben Caco-2-Zellen auch Variabilität in der Reaktionsfähigkeit gezeigt, aber konsistente relative Unterschiede in der Fe-Aufnahme zwischen Lebensmitteln beibehalten. Die richtige Technik und sorgfältige Liebe zum Detail können die konsistente Reaktion auf die Zellferritinbildung in Caco-2-Zellen verbessern.
Das In-vitro-Verdauungs-/Caco-2-Zellmodell wird auch als Caco-2-Zell-Bioassay bezeichnet. Dieser Assay wurde durch direkten Vergleich mit Human- und Tierstudien gründlich validiert22. Zusätzlich zum direkten parallelen Vergleich des Bioassays mit Wirksamkeitsstudien am Menschen zeigte dieses Modell eine qualitativ ähnliche Reaktion auf die Fe-Aufnahme wie beim Menschen18,19,23. Daher verdient der Caco-2-Zell-Bioassay als In-vitro-Ansatz eine hohe Glaubwürdigkeit als Screening-Tool zur Bewertung der Fe-Ernährung aus Lebensmitteln. Es wurde weit verbreitet auf zahlreiche Lebensmittel und Lebensmittel 21,24,25,26,27,28 angewendet.
Seit seiner Einführung im Jahr 1998 hat der Caco-2-Zellbioassay das Gebiet der Fe-Ernährung vorangebracht, da er dazu beigetragen hat, Faktoren zu identifizieren, die die intestinale Fe-Aufnahme beeinflussen. Auf diese Weise hat dieses Modell Forschungsziele für definitivere und kostengünstigere Studien am Menschen entwickelt und verfeinert. Man könnte auch argumentieren, dass die Verwendung des Modells die Notwendigkeit einiger menschlicher Versuche negiert.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die relative Abgabe von Fe aus einem Lebensmittel oder einer Mahlzeit mit dem Caco-2-Zell-Bioassay gemessen werden kann. Unabhängig von der Menge an Fe in der Testmahlzeit definiert der Bioassay die relative Menge an Fe, die in den Enterozyten aufgenommen wird – der erste Schritt des Absorptionsprozesses. Dies ist der wichtigste Schritt bei der Definition der Fe-Bioverfügbarkeit, da das Ziel meistens darin besteht, die Nährwertqualität von Fe in einem Lebensmittel zu verbessern oder zumindest zu überwachen. Da der Eisenstatus durch Absorption reguliert wird und somit die Fe-Aufnahme bei Personen mit Fe-Mangel hochreguliert wird, um den Ernährungsbedarf zu decken, sind die Standardbedingungen des Modells so konzipiert, dass die Fe-Aufnahme durch die Zellen maximal ist. Auf diese Weise liefert der Bioassay ein echtes Maß für das Potenzial der Nahrung, Fe zu liefern.
Protocol
Representative Results
Discussion
Seit seiner Einführung wurden zahlreiche Studien veröffentlicht, die diese Methode für den Caco-2-Zell-Bioassay beschreiben. Die Rahmenbedingungen sind seit der Erstveröffentlichung 1998 relativ unverändert geblieben18. In den letzten 20 Jahren wurden jedoch zahlreiche technische Details verfeinert und standardisiert, um eine beispiellose Konsistenz in der Reaktion des Bioassays zu erzielen. Die sorgfältige und präzise Einhaltung der Zellkultur und der In-vitro-Verdauungsbedingungen</em…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Der Autor ist zutiefst dankbar für die technischen Bemühungen von Yongpei Chang und Mary Bodis. Die äußerst erfolgreiche Anwendung dieses Modells im Bereich der Ernährung ist ein direktes Ergebnis ihrer Expertise und Liebe zum Detail. Die Entwicklung dieses Modells wurde vollständig vom United States Department of Agriculture, Agricultural Research Service, finanziert.
Materials
| 0.5 M HCl | Fisher Scientific | A508-4 Hydrochloric Acid TraceMetal Grade | |
| 18 megaohm water | Also known as distilled, deionized water | ||
| 3,3′,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt | Sigma Aldrich Co | T6397 | |
| 6-well plates | Costar | 3506 | Use for bioassay experiments |
| ascorbic acid | Sigma Aldrich Co | A0278 | |
| bile extract | Sigma Aldrich Co | B8631 | |
| Caco-2 cells | American Type Culture Collection | HTB-37 | HTB-37 is a common variety. |
| Cell culture flasks T225 | Falcon | 353138 | |
| Cell culture flasks T25 | Corning | 430639 | |
| Cell culture flasks T75 | Corning | 430641U | |
| Chelex-100 | Bio-Rad Laboratories Inc | 142832 | Known as the weak cation exchange resin in the protocol |
| collagen | Corning | 354236 | |
| dialysis membrane | Spectrum Laboratories | Spectra/Por 7 Pretreated RC Dialysis Tubing 15,000 MWCO | Spectra/Por 7 Pretreated RC Dialysis Tubing 15,000 MWCO |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Gibco | 12100046 | DMEM |
| epidermal growth factor | Sigma Aldrich Co | E4127-5X.1MG | |
| Ferritin ELISA Assay Kit | Eagle Biosciences | FRR31-K01 | |
| fetal bovine serum | R&D Systems | S12450 | Optima |
| HEPES | Sigma Aldrich Co | H3375 | |
| Hydrocortisone-Water Soluble | Sigma Aldrich Co | H0396 | |
| insert ring | Corning Costar | not sold | Transwell, for 6 well plate, without membrane |
| insulin | Sigma Aldrich Co | I2643 | |
| KCl | Sigma Aldrich Co | P9333 | |
| large column | VWR International | KT420400-1530 | |
| Minimum Essential Medium | Gibco | 41500034 | MEM |
| NaCl | Fisher Scientific | S271 | |
| pancreatin | Sigma Aldrich Co | P1750 | |
| PIPES disodium salt | Sigma Aldrich Co | Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid) disodium salt P3768 | |
| porcine pepsin | Sigma Aldrich Co | P6887 or (P7012-25G Sigma | |
| protein assay kit | Bio-Rad Laboratories Inc | Bio-Rad DC protein assay kit 500-0116 | Measurement of Caco-2 cell protein |
| silicone o rings | Web Seal, Inc Rochester NY | 2-215S500 | |
| sodium bicarbonate | Fisher Scientific | S233 | |
| Sodium selenite | Sigma Aldrich Co | S5261 | |
| ZellShield | Minerva Biolabs | 13-0050 | Use at 1% as antibiotic/antimycotic ordered through Thomas Scientific |
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