הקרנה בתפוקה גבוהה של מבודדים מיקרוביאליים עם השפעה על בריאות Caenorhabditis elegans

Summary

חיידקי מעיים עשויים להשפיע באופן חיובי או שלילי על בריאות המארח שלהם באמצעות מנגנונים ספציפיים או שמורים. Caenorhabditis elegans היא פלטפורמה נוחה לסינון עבור חיידקים כאלה. הפרוטוקול הנוכחי מתאר סינון בתפוקה גבוהה של 48 חיידקים מבודדים להשפעה על עמידות לעקה של נמטודה, המשמשים כפרוקסי לבריאות התולעים.

Abstract

עם גודלו הקטן, תוחלת החיים הקצרה והגנטיקה הקלה שלו, Caenorhabditis elegans מציע פלטפורמה נוחה לחקר ההשפעה של מבודדים מיקרוביאליים על הפיזיולוגיה של המארח. הוא גם פלואורסצנטי בכחול בעת המוות, ומספק אמצעי נוח לאיתור מוות. נכס זה נוצל לפיתוח מבחני הישרדות C. elegans ללא תוויות בתפוקה גבוהה (LFASS). אלה כוללים רישום פלואורסצנטי בהילוך מהיר של אוכלוסיות תולעים הקבועות בלוחות מרובי בתים, שמהם ניתן לגזור את זמן המוות החציוני של האוכלוסייה. המחקר הנוכחי מאמץ את גישת LFASS לסינון מבודדים מיקרוביאליים מרובים בו-זמנית עבור ההשפעות על הרגישות של C. elegans לחום חמור ולעקות חמצוניות. כאן מדווח על צינור סינון מיקרוביאלי כזה, שניתן להשתמש בו בעיקר כדי לסנן מראש פרוביוטיקה, תוך שימוש בעמידות קשה ללחץ כפרוקסי לבריאות המארח. הפרוטוקול מתאר כיצד לגדל הן את אוספי המיקרוביוטה המבודדת של המעיים C. elegans והן אוכלוסיות תולעים סינכרוניות במערכים מרובי תאים לפני שילובם למבחנים. הדוגמה שסופקה מכסה בדיקה של 47 חיידקים מבודדים וזן בקרה אחד על שני זני תולעים, בשני מבחני עקה במקביל. עם זאת, צינור הגישה ניתן להרחבה בקלות וישים לסינון של שיטות רבות אחרות. לפיכך, הוא מספק מערך רב-תכליתי לסקירה מהירה של נוף רב-פרמטרי של תנאים ביולוגיים וביוכימיים המשפיעים על בריאות C. elegans.

Introduction

בגוף האדם חיים כ-10-100 טריליון תאים מיקרוביאליים חיים (חיידקים, פטריות ארכאיות), המצויים בעיקר בסביבות המעיים, העור והרירית¹. במצב בריא, אלה מספקים יתרונות למארח שלהם, כולל ייצור ויטמינים, התבגרות של מערכת החיסון, גירוי של תגובות חיסוניות מולדות ונרכשות לפתוגנים, ויסות חילוף החומרים של השומן, ויסות תגובות ללחץ ועוד, עם השפעה על גדילה והתפתחות, התפרצות מחלות והזדקנות 2,3,4,5 . גם המיקרוביוטה של המעיים מתפתחת במידה ניכרת במהלך החיים. האבולוציה הדרסטית ביותר מתרחשת במהלך הינקות והילדות המוקדמת⁶, אך שינויים משמעותיים מתרחשים גם עם הגיל, כולל ירידה בשפע ביפידובקטריום ועלייה במינים קלוסטרידיום, לקטובצילוס, אנטרובקטריה ואנטרוקוקוס ⁷. אורח חיים יכול לשנות עוד יותר את ההרכב המיקרוביאלי של המעיים ולהוביל לדיסביוזיס (אובדן חיידקים מועילים, צמיחת יתר של חיידקים אופורטוניסטיים), וכתוצאה מכך פתולוגיות שונות כגון מחלות מעי דלקתיות, סוכרת והשמנת יתר⁵, אך גם לתרום למחלות אלצהיימר ופרקינסון 8,9,10,11^.

הבנה זו תרמה תרומה קריטית לעידון הרעיון של ציר המעי-מוח (GBA), שבו אינטראקציות בין הפיזיולוגיה של המעיים (כיום כולל המיקרובים שבתוכה) לבין מערכת העצבים נחשבות לווסת העיקרי של חילוף החומרים של בעלי החיים ולתפקודים פיזיולוגיים¹². עם זאת, התפקיד המדויק של המיקרוביוטה באיתות בין המעי למוח ומנגנוני הפעולה הקשורים אליו רחוקים מלהיות מובנים במלואם¹³. מאחר שמיקרוביוטה של המעיים היא גורם מפתח להזדקנות בריאה, האופן שבו חיידקים מווסתים את תהליך ההזדקנות הפך לנושא למחקר אינטנסיבי ולמחלוקת 6,14,15.

עם ההדגמה שהתולעת העגולה Caenorhabditis elegans מארחת מיקרוביוטה של המעי בונפיד הנשלטת – כמו במינים אחרים – על ידי Bacteroidetes, Firmicutes ו- Actinobacteria 16,17,18,19,20, עלייתה המהירה כפלטפורמה ניסיונית לחקר אינטראקציות בין המעי המארח ^{למעיים 21,22,23,24} ,^25,26 הרחיב משמעותית את ארסנל החקירות שלנו^26,27,28,29. בפרט, ניתן להתאים גישות ניסיוניות בעלות תפוקה גבוהה הזמינות עבור C. elegans לחקר תזונה גנטית, גנים-תרופות, גנים-פתוגנים וכו’, כדי לחקור במהירות כיצד חיידקים מבודדים וקוקטיילים משפיעים על הבריאות וההזדקנות של C. elegans.

הפרוטוקול הנוכחי מתאר צינור ניסיוני לסינון בבת אחת של מערכים של חיידקים מבודדים או תערובות שנקבעו בלוחות מרובי בתים להשפעות על עמידות ללחץ C. elegans כפרוקסי לבריאות, אשר ניתן להשתמש בהם כדי לזהות פרוביוטיקה. הוא מפרט כיצד לגדל אוכלוסיות תולעים גדולות ולטפל במערכי חיידקים בתבניות של לוחות 96 ו-384 בארות לפני עיבוד תולעים לניתוח אוטומטי של עמידות בפני עקה באמצעות קורא לוחות פלואורסצנטיים (איור 1). הגישה מבוססת על מבחני הישרדות אוטומטיים ללא תוויות (LFASS)³⁰ המנצלים את תופעת פלואורסצנציית המוות³¹, לפיה תולעים גוססות מייצרות פרץ של פלואורסצנציה כחולה שניתן להשתמש בה כדי לאתר את זמן המוות. פלואורסצנציה כחולה נפלטת על ידי אסטרים של גלוקוזיל של חומצה אנתרנילית המאוחסנים בגרגרי מעיים של C. elegans (סוג של אברונים הקשורים לליזוזום), אשר מתפוצצים כאשר מפל נמק מופעל במעי התולעת עם המוות³¹.

איור 1: זרימת עבודה ניסיונית לסינון בתפוקה גבוהה של חיידקים מבודדים עם השפעה על עמידות C. elegans ללחץ . (A) ציר זמן לתחזוקה והגדרת בדיקה של תולעים וחיידקים. (B) מערך לוחות חיידקים 96 באר התקנה וטיפול. (C) 384-באר צלחת תולעת. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Protocol

שני זני C. elegans ששימשו במקביל למחקר הנוכחי היו בריסטול N2 מסוג פראי ו-HT1890: daf-16(mgDf50), הגדלים בקצב דומה. עם זאת, ניתן לשכפל את הפרוטוקול עם כל שילוב של שני זנים בעלי קצב צמיחה דומה. שימו לב שכאשר בודקים זנים אחרים במקביל (למשל, מוטנטים מסוג wild ו-daf-2 שגדלים לאט), יש לקחת בחשבון קצבי גדיל…

Representative Results

מבחני LFASS מספקים סינון חזק, בעל תפוקה גבוהה ומהירה של תנאי בדיקה מרובים בו-זמנית, כגון סינון פרמטרים גנטיים ומיקרוביוטה רבים התורמים לעמידות ללחץ ולהזדקנות. לוקח רק 2-3 שבועות עד שהניסוי מקבל מערך נתונים נרחב של תנאי בדיקה מרובים. L4 + 36 שעות אוכלוסיות תולעי בר בוגרות נחשפו לעקה תרמית של 42 מעל?…

Discussion

C. elegans מציעה יתרונות רבים לסינון מהיר של מספר פרמטרים ניסיוניים בו זמנית, בשל גודלה הקטן, השקיפות, הפיתוח המהיר, תוחלת החיים הקצרה, הזולות וקלות הטיפול. הגנום, תוכנית הגוף, מערכת העצבים, המעיים והמיקרוביום הפשוטים הרבה יותר, אך מורכבים ודומים מספיק לבני אדם, הופכים אותו למודל פרה-קליני ?…

Materials

10 cm diameter plates (Non-vented)	Fisher Scientific	10720052	Venting is not necessary for bacterial cultures
15 cm diameter plates (Vented)	Fisher Scientific	168381
384-well black, transparent flat bottom plates	Corning	3712 or 3762	Not essential to be sterile for fast stress assays
6 cm diameter plates (Vented)	Fisher Scientific	150288	Venting is necessary for worm cultures to avoid hypoxia
96-well transparent plates (Biolite)	Thermo	130188
Agar (<4% ash)	Sigma-Aldrich	102218041	Good quality agar is important for the structural integrity of the culture media, to avoid worm burrowing
Agarose	Fisher Scientific	BP1356
Avanti Centrifuge J-26 XP	Beckman coulter
Bleach	Honeywell	425044
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	C5080
Centrifuge 5415 R	Eppendorf
Centrifuge 5810 R	Eppendorf
Cholesterol	Sigma-Aldrich	C8667
LB agar	Difco	240110
LB broth	Invitrogen	12795084
LoBind tips	VWR	732-1488	Lo-bind reduce worm loss during transfers
LoBind tubes	Eppendorf	22431081
Magnesium sulfate	Fisher Scientific	M/1100/53
Plate reader- infinite M nano+	Tecan		Monochromator setup enables fluorescence tuning but adequate filter-based setups may be used
Plate reader- Spark	Tecan
Potassium phosphate monobasic	Honeywell	P0662
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S/3160/63
Stereomicroscope setup with transillumination base	Leica	MZ6, or M80	Magnification from 0.6-0.8x up to 40-60x is necessary, as is a good quality transillumination base with a deformable, titable or slidable mirror to adjust contrast
t-BHP (tert-Butyl hydroperoxide)	Sigma-Aldrich	458139
Transparent adhesive seals Nunc	Fisher Scientific	101706871	It is important that it is transparent and that it can tolerate the temperatures involved in the assays.
Tryptophan	Sigma-Aldrich	1278-7099
Yeast extract	Fisher Scientific	BP1422