Reactivering van gedemembraneerde celmodellen in Chlamydomonas reinhardtii
Summary
De in vitro reactivering van beweeglijke cellen is een cruciaal experiment in het begrijpen van de mechanismen van celmotiliteit. Het protocol beschrijft het reactiveren van de gedemembraneerde celmodellen van Chlamydomonas reinhardtii, een modelorganisme om trilharen/flagellen te bestuderen.
Abstract
Sinds het historische experiment over de samentrekking van geglycerineerde spieren door toevoeging van ATP, dat Szent-Györgyi in het midden van de 20e eeuw aantoonde, is in vitro reactivering van gedemembraneerde cellen een traditionele en krachtige manier om de beweeglijkheid van cellen te onderzoeken. Het fundamentele voordeel van deze experimentele methode is dat de samenstelling van de reactiveringsoplossing gemakkelijk kan worden gewijzigd. Een omgeving met een hoge Ca2+ concentratie die slechts tijdelijk optreedt als gevolg van membraanexcitatie in vivo , kan bijvoorbeeld in het laboratorium worden gerepliceerd. Eukaryote trilharen (ook bekend als flagella) zijn uitgebreide motiliteitsmachines waarvan de regulerende mechanismen nog moeten worden opgehelderd. De eencellige groene alg Chlamydomonas reinhardtii is een uitstekend modelorganisme op het gebied van trilharen. De reactiveringsexperimenten met behulp van gedemembraneerde celmodellen van C. reinhardtii en hun derivaten, zoals gedemembraneerde axonemen van geïsoleerde trilharen, hebben aanzienlijk bijgedragen aan het begrijpen van de moleculaire mechanismen van ciliaire motiliteit. Die experimenten verduidelijkten dat ATP ciliaire motiliteit stimuleert en dat verschillende cellulaire signalen, waaronder Ca2 +, cAMP en reactieve zuurstofsoorten, ciliaire bewegingen moduleren. De precieze methode voor demembranatie van C. reinhardtii-cellen en reactivering van de celmodellen wordt hier beschreven.
Introduction
De in vitro reactivering van gedemembraneerde beweeglijke cellen is een waardevol hulpmiddel voor het bestuderen van de moleculaire basis voor het regulerende mechanisme van celmotiliteit. Szent-Györgyi toonde voor het eerst in vitro contractie van konijnenskeletspiervezels geëxtraheerd met 50% glycerol door toevoeging van adenosinetrifosfaat (ATP)1. Dit experiment was het eerste dat bewees dat ATP spiercontractie stimuleert. De methodologie werd al snel toegepast op de studie van ATP-bekrachtigde ciliaire / flagellaire motiliteit, zoals sperma flagella2, Paramecium cilia3 en Chlamydomonas reinhardtii cilia (ook wel flagella genoemd)4 met behulp van niet-ionische detergentia voor demembranatie.
De eencellige groene alg C. reinhardtii is een modelorganisme voor het bestuderen van trilharen: hij zwemt met twee trilharen door ze te slaan als een menselijke schoolslag5. Ciliaire beweging wordt aangedreven door dyneïne, een minus-end gericht motoreiwit op basis van microtubuli 6,7. Ciliaire dyneinen kunnen worden ingedeeld in dyneinen met de buitenarm en dyneinen met de binnenarm. Mutanten zonder elke soort dyneïne zijn geïsoleerd als langzaam zwemmende mutanten met verschillende motiliteitsafwijkingen. Gedetailleerde in vitro motiliteitsanalyse van deze mutanten heeft het dyneïneonderzoek aanzienlijk verbeterd8.
Veel belangrijke bevindingen zijn bereikt met behulp van deze methode en zijn derivaten sinds het in vitro reactiveringsexperiment van gedemembraneerde C. reinhardtii-cellen (celmodellen) werd vastgesteld. Reactivering van celmodellen in een reeks Ca2+ buffers toonde bijvoorbeeldaan 9 dat twee trilharen verschillend worden gereguleerd door submicromolair Ca2+, en deze asymmetrische trilharencontrole maakt de fototactische oriëntatie van C. reinhardtii10 mogelijk. Bovendien vertonen beide trilharen golfvormconversie van de voorwaartse zwemmodus (asymmetrische golfvorm genoemd) naar de achterwaartse zwemmodus (symmetrische golfvorm genoemd die gedurende een korte periode verschijnt wanneer cellen foto- of mechano-shocked zijn)11,12. Deze golfvormconversie wordt geregeld door submillimolar Ca2+, wat werd aangetoond door de reactivering van het zogenaamde nucleoflagellar-apparaat (een complex met twee trilharen, de basale lichamen, de structuren die de basale lichamen met de kern verbinden en het overblijfsel van de kern)11 of gedemembraneerde axonemen van geïsoleerde trilharen13. Anders dan Ca2 +, redox (reductie-oxidatie) evenwicht is een signaal dat de ciliaire kloppende frequentie reguleert, wat werd aangetoond door reactivering van celmodellen in redoxbuffers met verschillende verhoudingen van verminderde glutathion versus geoxideerde glutathion14. Bovendien reguleert cyclisch adenosinemonofosfaat (cAMP) asymmetrisch twee trilharen, wat werd aangetoond door de reactivering van axonemen met fotocleavable gekooide cAMP15. Deze in vitro bevindingen, gecombineerd met genetische bevindingen, hebben geleid tot een dieper begrip van de moleculaire mechanismen van trilharenregulatie in C. reinhardtii.
Een protocol voor het reactiveren van de celmodellen wordt hier beschreven. De methode is eenvoudig, maakt verschillende modificaties mogelijk en kan worden toegepast op meerdere organismen die met trilharen bewegen. Omdat gedemembraneerde cellen echter kwetsbaar zijn, zijn er enkele tips nodig om de beweeglijkheid van celmodellen met een goede efficiëntie te reactiveren en tegelijkertijd deciliatie te voorkomen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Er zijn twee cruciale stappen in dit protocol. De eerste is een proces dat bekend staat als demembranatie, dat voorzichtig maar grondig moet worden uitgevoerd. Deciliatie (d.w.z. het losmaken van trilharen van het cellichaam) wordt geïnduceerd door krachtig pipetteren of vortexen, waardoor de celmodellen onbeweeglijk worden, zelfs na de toevoeging van ATP. Typisch worden 5 × 107 cellen gesuspendeerd in ~ 0,5 ml demembranatiebuffer (uiteindelijke celdichtheid: 1 × 108 cellen / ml). De reactivering…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze studie werd ondersteund door subsidies van de Japan Society for the Promotion of Science KAKENHI (https://www.jsps.go.jp/english/index.html) aan de N.U. (19K23758, 21K06295) en K.W. (19H03242, 20K21420, 21H00420), van de Ohsumi Frontier Science Foundation (https://www.ofsf.or.jp/en/) aan K.W., en van de Dynamic Alliance for Open Innovation Bridging Human, Environment and Materials (http://alliance.tagen.tohoku.ac.jp/english/) aan N.U. en K.W. Wij danken mevrouw Miyuki Shinohara (Hosei Univ.) voor haar hulp bij het opstellen van de cijfers.
Materials
| 0.5 mL plastic tube | QSP | 502-PLN-Q | |
| 15 mL conical tube | SARSTEDT | 62.554.502 | |
| Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate (ATP) | Sima-Aldrich | A2383 | |
| Centrifuge | KUBOTA | 2800 | |
| Chlamydomonas strain CC-125 | Chlamydomonas Resource Center | https://www.chlamycollection.org/ | |
| Creatine kinase | Merck | CK-RO | |
| Creatine phosphate | Merck | CRPHO-RO | |
| Dithiothreitol (DTT) | Nakalai tesque | 14128-46 | |
| GEDTA(EGTA) | Dojindo | G002 | |
| Hepes | Dojindo | GB70 | |
| Igepal CA-630 | Sigma-Aldrich | I8896 | IUPAC name is octylphenoxypolyethoxyethanol: IGEPAL CA-630 is a substitute for Nonidet P-40 (NP-40); NP-40 is no longer available in Sigma-Aldrich. |
| MgSO4-7H2O | Nakalai tesque | 21002-85 | |
| Microscope | Olympus | BX-53 | |
| Pasteur pipette | fisher scientific | 13-678-20C | |
| Polyethylene glycol, Mr 20,000 | Merck | 8.18897.1000 | |
| Pottasium acetate | Nakalai tesque | 28434-25 | |
| Sodium Hydroxide | Nacalai | 31511-05 | |
| Sucrose | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 196-00015 |
References
- Szent-Gyorgyi, A. Free-energy relations and contraction of actomyosin. Biological Bulletin. 96 (2), 140-161 (1949).
- Hoffman-Berling, H. Adenosintriphosphat als betriebsstoff von zellbewegungen. Biochimica et Biophysica Acta. 14, 182-194 (1954).
- Naitoh, Y., Kaneko, H. Reactivated Triton-extracted models of Paramecium: modification of ciliary movement by calcium ions. Science. 176 (4034), 523-524 (1972).
- Witman, G. B., Plummer, J., Sander, G. Chlamydomonas flagellar mutants lacking radial spokes and central tubules. Structure, composition, and function of specific axonemal components. Journal of Cell Biology. 76 (3), 729-747 (1978).
- Rüffer, U., Nultsch, W. Flagellar coordination in Chlamydomonas cells held on micropipettes. Cell Motility and the Cytoskeleton. 41 (4), 297-307 (1998).
- Sale, W. S., Satir, P. Direction of active sliding of microtubules in Tetrahymena cilia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (5), 2045-2049 (1977).
- Fox, L. A., Sale, W. S. Direction of force generated by the inner row of dynein arms on flagellar microtubules. Journal of Cell Biology. 105 (4), 1781-1787 (1987).
- Kamiya, R., Yagi, T. Functional diversity of axonemal dyneins as assessed by in vitro and in vivo motility assays of Chlamydomonas mutants. Zoolog Science. 31 (10), 633-644 (2014).
- Kamiya, R., Witman, G.B. Submicromolar levels of calcium control the balance of beating between the two flagella in demembranated models of Chlamydomonas. Journal of Cell Biology. 98 (1), 97-107 (1984).
- Okita, N., Isogai, N., Hirono, M., Kamiya, R., Yoshimura, K. Phototactic activity in Chlamydomonas 'non-phototactic' mutants deficient in Ca2+-dependent control of flagellar dominance or in inner-arm dynein. Journal of Cell Science. 118 (Pt 3), 529-537 (2005).
- Hyams, J. S., Borisy, G. G. Isolated flagellar apparatus of Chlamydomonas: characterization of forward swimming and alteration of waveform and reversal of motion by calcium ions in vitro. Journal of Cell Science. 33, 235-253 (1978).
- Fujiu, K., Nakayama, Y., Yanagisawa, A., Sokabe, M., Yoshimura, K. Chlamydomonas CAV2 encodes a voltage- dependent calcium channel required for the flagellar waveform conversion. Current Biology. 19 (2), 133-139 (2009).
- Bessen, M., Fay, R. B., Witman, G. B. Calcium control of waveform in isolated flagellar axonemes of Chlamydomonas. Journal of Cell Biology. 86 (2), 446-455 (1980).
- Wakabayashi, K., King, S. M. Modulation of Chlamydomonas reinhardtii flagellar motility by redox poise. Journal of Cell Biology. 173 (5), 743-754 (2006).
- Saegusa, Y., Yoshimura, K. cAMP controls the balance of the propulsive forces generated by the two flagella of Chlamydomonas. Cytoskeleton. 72 (8), 412-421 (2015).
- Gorman, D. S., Levine, R. P. Cytochrome f and plastocyanin: their sequence in the photosynthetic electron transport chain of Chlamydomonas reinhardi. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 54 (6), 1665-1669 (1965).
- Takano, W., Hisabori, T., Wakabayashi, K. Rapid estimation of cytosolic ATP concentration from the ciliary beating frequency in the green alga Chlamydomonas reinhardtii. Journal of Biological Chemistry. 296, 100156 (2021).
- CALCON. http://www.bio.chuo-u.ac.jp/nano/calcon.html (2022).
- Wakabayashi, K., Yagi, T., Kamiya, R. Ca2+-dependent waveform conversion in the flagellar axoneme of Chlamydomonas mutants lacking the central-pair/radial spoke system. Cell Motility and the Cytoskeleton. 38 (1), 22-28 (1997).
- Yueh, Y. G., Crain, R. C. Deflagellation of Chlamydomonas reinhardtii follows a rapid transitory accumulation of inositol 1,4,5-trisphosphate and requires Ca2+ entry. Journal of Cell Biology. 123 (4), 869-875 (1993).
- Wakabayashi, K., Ide, T., Kamiya, R. Calcium-dependent flagellar motility activation in Chlamydomonas reinhardtii in response to mechanical agitation. Cell Motility and the Cytoskeleton. 66 (9), 736-742 (2009).
- Ueki, N., Wakabayashi, K. Detergent-extracted Volvox model exhibits an anterior-posterior gradient in flagellar Ca2+ sensitivity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (5), E1061-E1068 (2018).
- Tanno, A. et al. The four-celled Volvocales green alga Tetrabaena socialis exhibits weak photobehavior and high-photoprotection ability. PLoS One. 16 (10), e0259138 (2021).
