Immunolabeling og tælling af båndsynapser hos unge voksne og ældre Gerbil Cochleae
Summary
En protokol til behandling af unge voksne og alderen gerbil cochleae ved immunolabeling af de afferente synaptiske strukturer og hårceller, slukning af autofluorescens i alderen væv, dissekering og estimering af længden af cochleae og kvantificering af synapserne i billedstakke opnået med konfokal billeddannelse præsenteres.
Abstract
Tabet af båndsynapser, der forbinder indre hårceller og afferente auditive nervefibre, antages at være en årsag til aldersrelateret høretab. Den mest almindelige metode til påvisning af tab af båndsynapser er immunolabeling, fordi det giver mulighed for kvantitativ prøveudtagning fra flere tonotopiske steder i en individuel cochlea. Imidlertid er de interessante strukturer begravet dybt inde i den benede cochlea. Gerbils bruges som en dyremodel for aldersrelateret høretab. Her beskrives rutinemæssige protokoller for fiksering, immunolabeling af gerbil cochlear hele monteringer, konfokal billeddannelse og kvantificering af båndsynapsnumre og volumener. Desuden fremhæves de særlige udfordringer, der er forbundet med at opnå godt materiale fra værdifulde aldrende individer.
Gerbils aflives og enten perfunderes kardiovaskulært, eller deres tympaniske bullae dissekeres omhyggeligt ud af kraniet. Cochleae åbnes i toppen og bunden og overføres direkte til fikseringsmidlet. Uanset den oprindelige metode efterfikses cochleae og afkalkes derefter. Vævet mærkes derefter med primære antistoffer mod præ- og postsynaptiske strukturer og hårceller. Dernæst inkuberes cochleae med sekundære fluorescensmærkede antistoffer, der er specifikke mod deres respektive primære. Cochleae af alderen gerbils behandles derefter med en autofluorescens quencher for at reducere den typisk betydelige baggrundsfluorescens af ældre dyrs væv.
Endelig dissekeres cochleae i 6-11 segmenter. Hele cochlear-længden rekonstrueres således, at specifikke cochlear-steder kan bestemmes pålideligt mellem individer. Konfokale billedstakke, erhvervet sekventielt, hjælper med at visualisere hårceller og synapser på de valgte steder. De konfokale stakke dekonvoleres, og synapserne tælles enten manuelt ved hjælp af ImageJ, eller mere omfattende kvantificering af synaptiske strukturer udføres med billedanalyseprocedurer, der er specialskrevet i Matlab.
Introduction
Aldersrelateret høretab er en af verdens mest udbredte sygdomme, der rammer mere end en tredjedel af verdens befolkning i alderen 65 år og ældre1 år. De underliggende årsager er stadig under debat og undersøges aktivt, men kan omfatte tabet af de specialiserede synapser, der forbinder indre hårceller (IHC’er) med afferente auditive nervefibre2. Disse båndsynapser omfatter en præsynaptisk struktur, der har vesikler fyldt med neurotransmitteren glutamat bundet til det, såvel som postsynaptiske α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolpropionsyre (AMPA) glutamatreceptorer 3,4,5. I gerbilen kontakter ~ 20 afferente auditive nervefibre en IHC 6,7,8. Fibre på IHC, der vender mod modiolus, er imod store synaptiske bånd, mens fibrene, der forbinder på søjlesiden af IHC, står over for små synaptiske bånd (dvs. hos katte9, gerbils7, marsvin10 og mus 3,11,12,13,14). Desuden er størrelsen af de presynaptiske bånd og de postsynaptiske glutamatpletter i gerbilen positivt korreleret 7,14. Fibre, der er imod store bånd på den modiolære side af IHC, er små i kaliber og har lave spontane hastigheder og høje tærskler15. Der er tegn på, at fibre med lav spontan hastighed er mere sårbare over for støjeksponering10 og ototoksiske lægemidler16 end fibre med høj spontan lav tærskel, som er placeret på søjlesiden af IHC’er15.
Tabet af båndsynapser er den tidligste degenerative begivenhed i cochlear neural aldersrelateret høretab, mens tabet af spiralganglionceller og deres afferente auditive nervefibre halterbagefter 17,18. Elektrofysiologiske korrelater inkluderer optagelser af auditive hjernestammeresponser17 og sammensatte handlingspotentialer8; disse afspejler imidlertid ikke finesserne ved synapsetab, da fibre med lav spontan hastighed ikke bidrager til disse foranstaltninger16. Mere lovende elektrofysiologiske målinger er det massepotentialeafledte neurale indeks19 og peristimulus-tidsresponsen20. Disse er dog kun pålidelige, hvis dyret ikke har andre cochleapatologier ud over auditivt nervefibertab, der påvirker aktiviteten af de resterende auditive nervefibre8. Desuden var adfærdsmæssigt vurderede tærskler i gerbilen ikke korreleret med synapsetal21. Derfor er pålidelig kvantificering af overlevende båndsynapser og dermed antallet af funktionelle auditive nervefibre kun mulig ved direkte undersøgelse af cochlear-vævet.
Den mongolske gerbil (Meriones unguiculatus) er en velegnet dyremodel til undersøgelse af aldersrelateret høretab. Det har en kort levetid, har lavfrekvent hørelse svarende til mennesker, er let at vedligeholde og viser ligheder med menneskelige patologier relateret til aldersrelateret høretab 2,22,23,24. Gerbils betragtes som gamle, når de når 36 måneder, hvilket er nær slutningen af deres gennemsnitlige levetid22. Det er vigtigt, at der er påvist et aldersrelateret tab af båndsynapser i gerbils, der er hævet og ældet i rolige omgivelser 8,21.
Her præsenteres en protokol til immunolabel, dissekering og analyse af cochleae fra gerbils i forskellige aldre, fra unge voksne til alderen. Antistoffer rettet mod komponenter i presynapse (CtBP2), postsynaptiske glutamatreceptorplastrepletter (GluA2) og IHC’er (myoVIIa) anvendes. Der anvendes en autofluorescens quencher, der reducerer baggrunden i alderen cochleae og efterlader fluorescenssignalet intakt. Endvidere gives en beskrivelse af, hvordan man dissekerer cochlea for at undersøge både det sensoriske epitel og stria vascularis. Cochlear-længden måles for at gøre det muligt at vælge forskellige cochlea-steder, der svarer til specifikke bedste frekvenser25. Kvantificering af synapsenumre udføres med den frit tilgængelige software ImageJ26. Yderligere kvantificering af synapsevolumener og placeringer inden for den enkelte HC udføres med software, der er tilpasset skrevet i Matlab. Denne software gøres ikke offentligt tilgængelig, da forfatterne mangler ressourcer til at levere professionel dokumentation og support.
Protocol
Representative Results
Discussion
Med den metode, der er skitseret i denne protokol, er det muligt at immunolabel IHC’er og synaptiske strukturer i cochleae fra unge voksne og gamle gerbils, identificere formodede funktionelle synapser ved samtidig lokalisering af præ- og postsynaptiske elementer, allokere dem til individuelle IHC’er og kvantificere deres antal, volumen og placering. Antistofferne, der anvendes i denne tilgang, mærkede også ydre hårceller (OHC’er; myoVIIa) og deres præsynaptiske bånd. Desuden er et levedygtigt alternativ til immun…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne anerkender Lichun Zhang for at have hjulpet med at etablere metoden og Fluorescence Microscopy Service Unit, Carl von Ossietzky University of Oldenburg, for brugen af billeddannelsesfaciliteterne. Denne forskning blev finansieret af Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation) under Tysklands Excellence Strategy -EXC 2177/1.
Materials
| Albumin Fraction V biotin-free | Carl Roth | 0163.2 | |
| anti-CtBP2 (IgG1 monoclonal mouse) | BD Biosciences, Eysins | 612044 | |
| anti-GluA2 (IgG2a monoclonal mouse) | Millipore | MAB39 | |
| anti-mouse (IgG1)-AF 488 | Molecular Probes Inc. | A21121 | |
| anti-MyosinVIIa (IgG polyclonal rabbit) | Proteus Biosciences | 25e6790 | |
| Blade Holder & Breaker – Flat Jaws | Fine Science Tools | 10052-11 | |
| Bonn Artery Scissors – Ball Tip | Fine Science Tools | 14086-09 | |
| Coverslip thickness 1.5H, 24 x 60 mm | Carl Roth | LH26.1 | |
| Disposable Surgical Blade | Henry Schein | 0473 | |
| donkey anti-rabbit (IgG)-AF647 | Life Technologies-Molecular Probes | A-31573 | |
| Dumont #5 – Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Dumont #5SF Forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Ethanol, absolute 99.8% | Fisher Scientific | 12468750 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Carl Roth | 8040.2 | |
| Excel | Microsoft Corporation | ||
| Feather Double Edge Blade | PLANO | 112-9 | |
| G19 Cannula | Henry Schein | 9003633 | |
| goat anti-mouse (IgG2a)-AF568 | Invitrogen | A-21134 | |
| Heparin | Ratiopharm | N68542.04 | |
| Huygens Essentials | Scientific Volume Imaging | ||
| ImageJ | Fiji | ||
| Immersol, Immersion oil 518F | Carl Zeiss | 10539438 | |
| Intrafix Primeline Classic, 150 cm (mit Datamatrix Code auf der Sterilverpackung) | Braun | 4062957E | |
| ISM596D | Ismatec | peristaltic pump | |
| KL 1600 LED | Schott | 150.600 | light source for stereomicroscope |
| Leica Application suite X | Leica Microsystem CMS GmbH | ||
| Leica TCS SP8 system | Leica Microsystem CMS GmbH | ||
| Matlab | The Mathworks Inc. | ||
| Mayo Scissors Tungston Carbide ToghCut | Fine Science Tools | 14512-17 | |
| Mini-100 Orbital-Genie | Scientific Industries | SI-M100 | for use in cold environment |
| Narcoren (pentobarbital) | Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH | ||
| Nikon Eclipse Ni-Ei | Nikon | ||
| NIS Elements | Nikon Europe B.V. | ||
| Paraformaldehyde | Carl Roth | 0335.3 | |
| Petri dish without vents | Avantor VWR | 390-1375 | |
| Phosphate-buffered saline: | |||
| Disodium phosphate | AppliChem | A1046 | |
| Monopotassium phosphate | Carl Roth | 3904.1 | |
| Potassium chloride | Carl Roth | 6781.1 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | 31434-M | |
| Screw Cap Containers | Sarstedt | 75.562.300 | |
| Sodium azide | Carl Roth | K305.1 | |
| Student Adson Forceps | Fine Science Tools | 91106-12 | |
| Student Halsted-Mosquito Hemostat | Fine Science Tools | 91308-12 | |
| Superfrost Adhesion Microscope Slides | Epredia | J1800AMNZ | |
| Triton X | Carl Roth | 3051.2 | |
| TrueBlack Lipofuscin Autofluorescence Quencher | Biotium | 23007 | |
| Vannas Spring Scissors, 3mm | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Vectashield Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Vibrax VXR basic | IKA | 0002819000 | |
| VX 7 Dish attachment for Vibrax VXR basic | IKA | 953300 | |
| Wild TYP 355110 (Stereomicroscope) | Wild Heerbrugg | not available anymore |
References
- Liberman, M. C. Noise-induced and age-related hearing loss: new perspectives and potential therapies [version 1; peer review. F1000Research. 6 (927), (2017).
- Heeringa, A. N., Koeppl, C. The aging cochlea: Towards unraveling the functional contributions of strial dysfunction and synaptopathy. Hearing. 376, 111-124 (2019).
- Liberman, L. D., Wang, H., Liberman, M. C. Opposing gradients of ribbon size and AMPA receptor expression underlie sensitivity differences among cochlear-nerve/hair-cell synapses. The Journal of Neuroscience. 31 (3), 801-808 (2011).
- Khimich, D., et al. Hair cell synaptic ribbons are essential for synchronous auditory signalling. Nature. 434 (7035), 889-894 (2005).
- Pangršič, T., et al. Hearing requires otoferlin-dependent efficient replenishment of synaptic vesicles in hair cells. Nature Neuroscience. 13 (7), 869-876 (2010).
- Meyer, A. C., et al. Tuning of synapse number, structure and function in the cochlea. Nature Neuroscience. 12 (4), 444-453 (2009).
- Zhang, L., Engler, S., Koepcke, L., Steenken, F., Koeppl, C. Concurrent gradients of ribbon volume and AMPA-receptor patch volume in cochlear afferent synapses on gerbil inner hair cells. Hearing Research. 364, 81-89 (2018).
- Steenken, F., et al. Age-related decline in cochlear ribbon synapses and its relation to different metrics of auditory-nerve activity. Neurobiology of Aging. 108, 133-145 (2021).
- Merchan-Perez, A., Liberman, M. C. Ultrastructural differences among afferent synapses on cochlear hair cells: Correlations with spontaneous discharge rate. Journal of Comparative Neurology. 371 (2), 208-221 (1996).
- Furman, A. C., Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Noise-induced cochlear neuropathy is selective for fibers with low spontaneous rates. Journal of Neurophysiology. 110 (3), 577-586 (2013).
- Gilels, F., Paquette, S. T., Zhang, J., Rahman, I., White, P. M. Mutation of Foxo3 causes adult onset auditory neuropathy and alters cochlear synapse architecture in mice. The Journal of Neuroscience. 33 (47), 18409-18424 (2013).
- Yin, Y., Liberman, L. D., Maison, S. F., Liberman, M. C. Olivocochlear innervation maintains the normal modiolar-pillar and habenular-cuticular gradients in cochlear synaptic morphology. Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 15 (4), 571-583 (2014).
- Paquette, S. T., Gilels, F., White, P. M. Noise exposure modulates cochlear inner hair cell ribbon volumes, correlating with changes in auditory measures in the FVB/nJ mouse. Scientific Reports. 6 (1), 25056 (2016).
- Reijntjes, D. O. J., Köppl, C., Pyott, S. J. Volume gradients in inner hair cell-auditory nerve fiber pre- and postsynaptic proteins differ across mouse strains. Hearing Research. 390, 107933 (2020).
- Liberman, M. C. Single-neuron labeling in the cat auditory nerve. Science. 216 (4551), 1239-1241 (1982).
- Bourien, J., et al. Contribution of auditory nerve fibers to compound action potential of the auditory nerve. Journal of Neurophysiology. 112 (5), 1025-1039 (2014).
- Sergeyenko, Y., Lall, K., Liberman, M. C., Kujawa, S. G. Age-related cochlear synaptopathy: An early-onset contributor to auditory functional decline. The Journal of Neuroscience. 33 (34), 13686-13694 (2013).
- Viana, L. M., et al. Cochlear neuropathy in human presbycusis: Confocal analysis of hidden hearing loss in post-mortem tissue. Hearing Research. 327, 78-88 (2015).
- Batrel, C., et al. Mass potentials recorded at the round window enable the detection of low spontaneous rate fibers in gerbil auditory nerve. PLoS ONE. 12 (1), 0169890 (2017).
- Jeffers, P. W. C., Bourien, J., Diuba, A., Puel, J. -. L., Kujawa, S. G. Noise-induced hearing loss in gerbil: Round window assays of synapse loss. Frontiers in Cellular Neuroscience. 15, 699978 (2021).
- Gleich, O., Semmler, P., Strutz, J. Behavioral auditory thresholds and loss of ribbon synapses at inner hair cells in aged gerbils. Experimental Gerontology. 84, 61-70 (2016).
- Cheal, M. The gerbil: A unique model for research on aging. Experimental Aging Research. 12 (1), 3-21 (1986).
- Gates, G. A., Mills, J. H. Presbycusis. The Lancet. 366 (9491), 1111-1120 (2005).
- Ryan, A. F. Hearing sensitivity of the gerbil, Meriones unguiculatis. The Journal of the Acoustical Society of America. 59 (5), 1222-1226 (1976).
- Müller, M. The cochlear place-frequency map of the adult and developing gerbil. Hearing Research. 94 (1-2), 148-156 (1996).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Reijntjes, D. O. J., Breitzler, J. L., Persic, D., Pyott, S. J. Preparation of the intact rodent organ of Corti for RNAscope and immunolabeling, confocal microscopy, and quantitative analysis. STAR Protocols. 2 (2), 100544 (2021).
- Hickman, T. T., Hashimoto, K., Liberman, L. D., Liberman, M. C. Synaptic migration and reorganization after noise exposure suggests regeneration in a mature mammalian cochlea. Scientific Reports. 10 (1), 19945 (2020).
- Gray, D. A., Woulfe, J. Lipofuscin and aging: a matter of toxic waste. Science of Aging Knowledge Environment: SAGE KE. 2005 (5), 1 (2005).
- Li, H. -. S., Hultcrantz, M. Age-related degeneration of the organ of Corti in two genotypes of mice. ORL; Journal for Oto-rhino-laryngology and Its Related Specialties. 56 (2), 61-67 (1994).
- Kobrina, A., et al. Linking anatomical and physiological markers of auditory system degeneration with behavioral hearing assessments in a mouse (Mus musculus) model of age-related hearing loss. Neurobiology of Aging. 96, 87-103 (2020).
- Moreno-García, A., Kun, A., Calero, O., Medina, M., Calero, M. An overview of the role of lipofuscin in age-related neurodegeneration. Frontiers in Neuroscience. 12, 464 (2018).
- Jensen, T., Holten-Rossing, H., Svendsen, I., Jacobsen, C., Vainer, B. Quantitative analysis of myocardial tissue with digital autofluorescence microscopy. Journal of Pathology Informatics. 7, 15 (2016).
- Kalluri, R., Monges-Hernandez, M. Spatial gradients in the size of inner hair cell ribbons emerge before the onset of hearing in rats. Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 18 (3), 399-413 (2017).
- Wu, P. Z., Liberman, L. D., Bennett, K., de Gruttola, V., O’Malley, J. T., Liberman, M. C. Primary neural degeneration in the human cochlea: Evidence for hidden hearing loss in the aging ear. 신경과학. 407, 8-20 (2019).
