Immunolabeling and Counting Ribbon Synapses in Young Adult and Aged Gerbil Cochleae
Summary
Viene presentato un protocollo per l’elaborazione di coclee di gerbillo giovani adulti e invecchiati immunomarcando le strutture sinaptiche afferenti e le cellule ciliate, spegnendo l’autofluorescenza nei tessuti invecchiati, sezionando e stimando la lunghezza delle coclee e quantificando le sinapsi in pile di immagini ottenute con l’imaging confocale.
Abstract
Si presume che la perdita di sinapsi a nastro che collegano le cellule ciliate interne e le fibre nervose uditive afferenti sia una delle cause della perdita dell’udito legata all’età. Il metodo più comune per rilevare la perdita di sinapsi del nastro è l’immunolabeling perché consente il campionamento quantitativo da diverse posizioni tonotopiche in una singola coclea. Tuttavia, le strutture di interesse sono sepolte in profondità all’interno della coclea ossea. I gerbilli sono usati come modello animale per la perdita dell’udito legata all’età. Qui vengono descritti i protocolli di routine per la fissazione, l’immunolabeling dei gerbilli cocleari interi mount, l’imaging confocale e la quantificazione dei numeri e dei volumi delle sinapsi del nastro. Inoltre, vengono evidenziate le particolari sfide associate all’ottenimento di buon materiale da individui invecchiati di valore.
I gerbilli vengono eutanasizzati e perfusi per via cardiovascolare, o le loro bolle timpaniche vengono accuratamente sezionate fuori dal cranio. Le coclee vengono aperte all’apice e alla base e trasferite direttamente al fissativo. Indipendentemente dal metodo iniziale, le coclee vengono postfisse e successivamente decalcificate. Il tessuto viene quindi etichettato con anticorpi primari contro le strutture pre- e postsinaptiche e le cellule ciliate. Successivamente, le coclee vengono incubate con anticorpi secondari marcati con fluorescenza che sono specifici contro i rispettivi primari. Le coclee dei gerbilli invecchiati vengono quindi trattate con un quencher di autofluorescenza per ridurre la fluorescenza di fondo tipicamente sostanziale dei tessuti degli animali più anziani.
Infine, le coclee vengono sezionate in 6-11 segmenti. L’intera lunghezza cocleare viene ricostruita in modo tale che specifiche posizioni cocleari possano essere determinate in modo affidabile tra gli individui. Le pile di immagini confocali, acquisite in sequenza, aiutano a visualizzare le cellule ciliate e le sinapsi nei luoghi scelti. Le pile confocali sono deconvolte e le sinapsi vengono contate manualmente utilizzando ImageJ, oppure viene eseguita una quantificazione più estesa delle strutture sinaptiche con procedure di analisi delle immagini scritte su misura in Matlab.
Introduction
La perdita dell’udito legata all’età è una delle malattie più diffuse al mondo che colpisce più di un terzo della popolazione mondiale di età pari o superiore a 65 anni e1. Le cause sottostanti sono ancora in discussione e attivamente indagate, ma possono includere la perdita delle sinapsi specializzate che collegano le cellule ciliate interne (IHC) con le fibre nervose uditive afferenti2. Queste sinapsi a nastro comprendono una struttura presinaptica che ha vescicole piene del neurotrasmettitore glutammato legato ad esso, così come i recettori del glutammato postsinaptico α-ammino-3-idrossi-5-metil-4-isossazolepropionico (AMPA) 3,4,5. Nel gerbillo, ~ 20 fibre nervose uditive afferenti contattano un IHC 6,7,8. Le fibre sull’IHC di fronte al modiolo si oppongono ai grandi nastri sinaptici, mentre le fibre che si collegano sul lato del pilastro dell’IHC affrontano piccoli nastri sinaptici (cioè nei gatti9, gerbilli7, porcellini d’India10 e topi 3,11,12,13,14). Inoltre, nel gerbillo, la dimensione dei nastri presinaptici e dei cerotti di glutammato postsinaptico sono positivamente correlati 7,14. Le fibre che si oppongono ai grandi nastri sul lato modiolare dell’IHC sono di piccolo calibro e hanno bassi tassi spontanei e soglie elevate15. Ci sono prove che le fibre a basso tasso spontaneo sono più vulnerabili all’esposizione al rumore10 e ai farmaci ototossici16 rispetto alle fibre a bassa soglia ad alta spontaneità, che si trovano sul lato del pilastro degli IHC15.
La perdita di sinapsi del nastro è il primo evento degenerativo nella perdita dell’udito correlata all’età neurale cocleare, mentre la perdita delle cellule gangliari a spirale e delle loro fibre nervose uditive afferenti è in ritardo rispetto a17,18. I correlati elettrofisiologici includono registrazioni delle risposte uditive del tronco cerebrale17 e dei potenziali d’azione composti8; tuttavia, questi non riflettono le sottigliezze della perdita di sinapsi, poiché le fibre a basso tasso spontaneo non contribuiscono a queste misure16. Metriche elettrofisiologiche più promettenti sono l’indice neurale derivato dal potenziale di massa19 e la risposta temporale peristimulo20. Tuttavia, questi sono affidabili solo se l’animale non ha altre patologie cocleari, oltre alla perdita di fibre nervose uditive, che influenzano l’attività delle restanti fibre nervose uditive8. Inoltre, le soglie valutate comportamentalmente nel gerbillo non erano correlate con i numeri di sinapsi21. Pertanto, una quantificazione affidabile delle sinapsi del nastro sopravvissute e, quindi, del numero di fibre nervose uditive funzionali è possibile solo mediante l’esame diretto del tessuto cocleare.
Il gerbillo mongolo (Meriones unguiculatus) è un modello animale adatto per lo studio della perdita dell’udito legata all’età. Ha una breve durata della vita, ha un udito a bassa frequenza simile agli esseri umani, è facile da mantenere e mostra somiglianze con patologie umane legate alla perdita dell’udito legata all’età 2,22,23,24. I gerbilli sono considerati invecchiati quando raggiungono i 36 mesi di età, che è vicino alla fine della loro vita mediadi 22 anni. È importante sottolineare che una perdita di sinapsi del nastro legata all’età è stata dimostrata in gerbilli allevati e invecchiati in ambienti tranquilli 8,21.
Qui viene presentato un protocollo per immunolabel, sezionare e analizzare le coclee da gerbilli di diverse età, dai giovani adulti agli anziani. Vengono utilizzati anticorpi diretti contro i componenti della presinapsi (CtBP2), i cerotti del recettore postsinaptico del glutammato (GluA2) e gli IHC (myoVIIa). Viene applicato un quencher ad autofluorescenza che riduce lo sfondo nelle coclee invecchiate e lascia intatto il segnale di fluorescenza. Inoltre, viene fornita una descrizione di come sezionare la coclea per esaminare sia l’epitelio sensoriale che la stria vascolare. La lunghezza cocleare viene misurata per consentire la selezione di posizioni cocleari distinte che corrispondono a specifiche migliori frequenze25. La quantificazione dei numeri delle sinapsi viene effettuata con il software liberamente disponibile ImageJ26. Un’ulteriore quantificazione dei volumi e delle posizioni delle sinapsi all’interno del singolo HC viene eseguita con un software personalizzato scritto in Matlab. Questo software non è reso disponibile al pubblico, in quanto gli autori non hanno le risorse per fornire documentazione e supporto professionali.
Protocol
Representative Results
Discussion
Con il metodo delineato in questo protocollo, è possibile immunostare IHC e strutture sinaptiche nelle coclee da gerbilli giovani adulti e anziani, identificare presunte sinapsi funzionali mediante co-localizzazione di elementi pre- e postsinaptici, assegnarle a singoli IHC e quantificare il loro numero, volume e posizione. Gli anticorpi utilizzati in questo approccio hanno anche etichettato le cellule ciliate esterne (OHC; mioVIIa) e i loro nastri presinaptici. Inoltre, una valida alternativa per l’immunolabeling sia …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori riconoscono Lichun Zhang per aver contribuito a stabilire il metodo e l’unità di servizio di microscopia a fluorescenza, Carl von Ossietzky University di Oldenburg, per l’uso delle strutture di imaging. Questa ricerca è stata finanziata dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Fondazione tedesca per la ricerca) nell’ambito della strategia di eccellenza della Germania -EXC 2177/1.
Materials
| Albumin Fraction V biotin-free | Carl Roth | 0163.2 | |
| anti-CtBP2 (IgG1 monoclonal mouse) | BD Biosciences, Eysins | 612044 | |
| anti-GluA2 (IgG2a monoclonal mouse) | Millipore | MAB39 | |
| anti-mouse (IgG1)-AF 488 | Molecular Probes Inc. | A21121 | |
| anti-MyosinVIIa (IgG polyclonal rabbit) | Proteus Biosciences | 25e6790 | |
| Blade Holder & Breaker – Flat Jaws | Fine Science Tools | 10052-11 | |
| Bonn Artery Scissors – Ball Tip | Fine Science Tools | 14086-09 | |
| Coverslip thickness 1.5H, 24 x 60 mm | Carl Roth | LH26.1 | |
| Disposable Surgical Blade | Henry Schein | 0473 | |
| donkey anti-rabbit (IgG)-AF647 | Life Technologies-Molecular Probes | A-31573 | |
| Dumont #5 – Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Dumont #5SF Forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Ethanol, absolute 99.8% | Fisher Scientific | 12468750 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Carl Roth | 8040.2 | |
| Excel | Microsoft Corporation | ||
| Feather Double Edge Blade | PLANO | 112-9 | |
| G19 Cannula | Henry Schein | 9003633 | |
| goat anti-mouse (IgG2a)-AF568 | Invitrogen | A-21134 | |
| Heparin | Ratiopharm | N68542.04 | |
| Huygens Essentials | Scientific Volume Imaging | ||
| ImageJ | Fiji | ||
| Immersol, Immersion oil 518F | Carl Zeiss | 10539438 | |
| Intrafix Primeline Classic, 150 cm (mit Datamatrix Code auf der Sterilverpackung) | Braun | 4062957E | |
| ISM596D | Ismatec | peristaltic pump | |
| KL 1600 LED | Schott | 150.600 | light source for stereomicroscope |
| Leica Application suite X | Leica Microsystem CMS GmbH | ||
| Leica TCS SP8 system | Leica Microsystem CMS GmbH | ||
| Matlab | The Mathworks Inc. | ||
| Mayo Scissors Tungston Carbide ToghCut | Fine Science Tools | 14512-17 | |
| Mini-100 Orbital-Genie | Scientific Industries | SI-M100 | for use in cold environment |
| Narcoren (pentobarbital) | Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH | ||
| Nikon Eclipse Ni-Ei | Nikon | ||
| NIS Elements | Nikon Europe B.V. | ||
| Paraformaldehyde | Carl Roth | 0335.3 | |
| Petri dish without vents | Avantor VWR | 390-1375 | |
| Phosphate-buffered saline: | |||
| Disodium phosphate | AppliChem | A1046 | |
| Monopotassium phosphate | Carl Roth | 3904.1 | |
| Potassium chloride | Carl Roth | 6781.1 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | 31434-M | |
| Screw Cap Containers | Sarstedt | 75.562.300 | |
| Sodium azide | Carl Roth | K305.1 | |
| Student Adson Forceps | Fine Science Tools | 91106-12 | |
| Student Halsted-Mosquito Hemostat | Fine Science Tools | 91308-12 | |
| Superfrost Adhesion Microscope Slides | Epredia | J1800AMNZ | |
| Triton X | Carl Roth | 3051.2 | |
| TrueBlack Lipofuscin Autofluorescence Quencher | Biotium | 23007 | |
| Vannas Spring Scissors, 3mm | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Vectashield Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Vibrax VXR basic | IKA | 0002819000 | |
| VX 7 Dish attachment for Vibrax VXR basic | IKA | 953300 | |
| Wild TYP 355110 (Stereomicroscope) | Wild Heerbrugg | not available anymore |
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