Masaüstü Reometre Kullanarak Hava Yolu Mukusunun Hızlı Viskoelastik Karakterizasyonu
Summary
Mukusun viskoelastik özellikleri mukosiliyer klirenste kritik bir rol oynamaktadır. Bununla birlikte, geleneksel mukus reolojik teknikleri karmaşık ve zaman alıcı yaklaşımlar gerektirir. Bu çalışma, viskoelastik ölçümleri hızlı ve güvenilir bir şekilde gerçekleştirebilen bir tezgah üstü reometrenin kullanımı için ayrıntılı bir protokol sunmaktadır.
Abstract
Muko-obstrüktif akciğer hastalıklarında (örneğin, astım, kronik obstrüktif akciğer hastalığı, kistik fibroz) ve diğer solunum koşullarında (örneğin, viral / bakteriyel enfeksiyonlar), mukus biyofiziksel özellikleri kadeh hücresi hipersekresyonu, hava yolu dehidrasyonu, oksidatif stres ve hücre dışı DNA varlığı ile değişir. Önceki çalışmalar, balgam viskoelastisitesinin solunum fonksiyonu ile ilişkili olduğunu ve balgam reolojisini etkileyen tedavilerin (örneğin, mukolitikler) dikkate değer klinik faydalarla sonuçlanabileceğini göstermiştir. Genel olarak, Newton olmayan sıvıların reolojik ölçümleri, tahlili gerçekleştirmek ve verileri yorumlamak için kapsamlı eğitim gerektiren ayrıntılı, zaman alıcı yaklaşımlar (örneğin, paralel / koni plakası reometreleri ve / veya mikroboncuk parçacık izleme) kullanır. Bu çalışma, 5 dakika içinde klinik numuneler için doğrusal viskoelastik modül (G’, G”, G * ve bronzluk δ) ve jel noktası özellikleri (γ c ve σc) sağlamak için kesme gerinimi süpürme ile dinamik salınım kullanarak hızlı ölçümler yapmak üzere tasarlanmış kullanıcı dostu bir tezgah üstü cihaz olan Rheomuco’nun güvenilirliğini, tekrarlanabilirliğini ve hassasiyetini test etmiştir. Cihaz performansı, mukus simulantının farklı konsantrasyonları, 8 MDa polietilen oksit (PEO) kullanılarak ve geleneksel toplu reoloji ölçümlerine karşı doğrulandı. Daha sonra status asthmaticus (SA) olan entübe edilmiş bir hastadan alınan klinik izolat, üçlü ölçümlerde değerlendirildi ve ölçümler arasındaki varyasyon katsayısı %<10'dur. SA mukus üzerinde güçlü bir mukus indirgeyici ajan olan TCEP'in ex-vivo kullanımı, elastik modülde beş kat azalmaya ve genel olarak daha “sıvı benzeri” bir davranışa doğru bir değişikliğe neden olmuştur (örneğin, daha yüksek bronzluk δ). Birlikte, bu sonuçlar test edilen tezgah üstü reometrenin klinik ve araştırma ortamlarında mukus viskoelastisitesinin güvenilir ölçümlerini yapabileceğini göstermektedir. Özetle, tarif edilen protokol, mukoaktif ilaçların (örneğin, rhDNaz, N-asetil sistein) vaka bazında tedaviyi uyarlamak için yerinde veya yeni bileşiklerin klinik öncesi çalışmalarında etkilerini araştırmak için kullanılabilir.
Introduction
Astım, kronik obstrüktif akciğer hastalığı (KOAH), kistik fibroz (KF) ve viral ve bakteriyel pnömoni gibi diğer solunum yolu rahatsızlıkları dahil olmak üzere muko-obstrüktif hava yolu hastalıkları dünya çapında yaygın sağlık sorunlarıdır. Patofizyoloji her durum arasında büyük farklılıklar gösterse de, ortak bir anahtar özellik anormal mukosiliyer klirenstir. Sağlıklı akciğerlerde mukus, solunan parçacıkları yakalamak ve patojenlere karşı fiziksel bir bariyer sağlamak için hava yolu epitelini hizalar. Salgılandıktan sonra, ~% 97.5 su,% 0.9 tuz, ~% 1.1 küresel proteinler ve ~% 0.5 müsinlerden oluşan hava yolu mukusları, kirpiklerin koordineli bir şekilde atılmasıyla kademeli olarak glottise doğru taşınır 1,2. Müsinler, verimli taşıma için gerekli olan mukusun farklı viskoelastik özelliklerini sağlamak için kovalent olmayan ve kovalent bağlar yoluyla etkileşime giren büyük O’ya bağlı glikoproteinlerdir3. Değişmiş iyon taşınması, müsin açılması, elektrostatik etkileşimler, çapraz bağlanma veya bileşimdeki değişikliklerin neden olduğu müsin ağının ultrayapısındaki değişiklikler, mukus viskoelastisitesini önemli ölçüde etkileyebilir ve mukosiliyer klirensi bozabilir 4,5. Bu nedenle, hava yolu mukusunun biyofiziksel özelliklerindeki değişikliklerin belirlenmesi, hastalık patogenezini anlamak ve yeni mukoaktif bileşiklerin test edilmesi için gereklidir6.
Çeşitli faktörler akciğerlerde anormal mukus üretimine yol açabilir. KOAH’ta sigara dumanının kronik olarak solunması, kadeh hücresi metaplazisinin bir sonucu olarak mukus hipersekresyonunu ve ayrıca kistik fibroz transmembran iletkenlik düzenleyicisi (CFTR) kanalının downregülasyonu yoluyla hava yolu dehidrasyonunu tetikleyerek mukus hiperkonsantrasyonuna ve küçük hava yolu tıkanıklığına neden olur 7,8. Benzer şekilde, CFTR genindeki mutasyonlarla ilişkili genetik bir bozukluk olan CF, taşımaiçin yetersiz olan viskoz, yapışkan mukus üretimi ile karakterizedir 8,9. Kısacası, CFTR disfonksiyonu, hava yolu yüzey sıvısının tükenmesine, polimerik müsin dolaşıklığına ve artmış biyokimyasal etkileşimlere neden olarak kronik inflamasyon ve bakteriyel enfeksiyonlara neden olur. Ek olarak, statik mukusta sıkışmış enflamatuar hücreler, jel matrisine başka bir büyük molekül olan DNA’yı ekleyerek mukusun viskoelastisitesini daha da kötüleştirir ve hava yolu tıkanıklığını kötüleştirir5. Mukus reolojisinin akciğerlerin genel sağlığı üzerindeki öneminin en iyi örneklerinden biri, kistik fibrozis hastalarının tedavisinde rekombinant insan DNFaz (rhDNaz) örneği ile sağlanmaktadır. RhDNaz’ın etkileri ilk olarak10,11 dakika içinde viskoz mukustan akan bir sıvıya geçiş gösteren balgam söktürücü balgam üzerinde ex vivo olarak gösterilmiştir. KF hastalarında yapılan klinik çalışmalar, rhDNaz inhalasyonu ile hava yolu mukus viskoelastisitesinin azaltılmasının pulmoner alevlenme oranını azalttığını ve akciğer fonksiyonunu ve genel hasta refahını iyileştirdiğini göstermiştir12,13,14. Sonuç olarak, klirensi kolaylaştırmayı amaçlayan rhDNaz inhalasyonu, yirmi yıldan fazla bir süredir KF hastaları için standart bakım haline gelmiştir. Benzer klinik faydalar, KF’de mukus hidrasyonu için inhale hipertonik salin kullanımı ile gözlenmiştir, bu da reolojik özelliklerdeki değişikliklerle korelasyon göstermiş ve mukosiliyer klirens ivmesi ve akciğer fonksiyonunun iyileşmesi ile sonuçlanmıştır15,16. Bu nedenle, klinik ortamlarda mukus viskoelastik özelliklerini ölçmek için hızlı ve güvenilir bir protokol, terapötik yaklaşımları optimize etmek için önemlidir.
Burada test edilen tezgah üstü reometre, mukus/balgam numunelerinin kapsamlı viskoelastik ölçümlerini gerçekleştirmek için hızlı ve kullanışlı bir alternatif sunmaktadır. Kontrollü açısal yer değiştirmeli dinamik salınımlar kullanan cihaz, torku ve yer değiştirmeyi 15 nN çözünürlüklerle ölçmek için bir çift ayarlanabilir paralel plaka (örneğin, kaba veya pürüzsüz geometriler) aracılığıyla deformasyon sağlar. m ve 150 nm, sırasıyla17. Reoloji uzmanı olmayanlar için uyarlanmış kullanıcı kılavuzlarıyla birlikte varsayılan standartlaştırılmış kalibrasyon, basit ölçümlere olanak tanır ve operatör hataları riskini azaltır. Cihaz, gerçek zamanlı olarak (~ 5 dakika içinde) işlenen ve analiz edilen bir gerinim süpürme eğrisi üretir ve otomatik olarak hem doğrusal viskoelastik (G’, G”, G * ve ten rengi δ) hem de jel noktası (γ c ve σc) özelliklerini sağlar (bkz. Tablo 1). Elastik veya depolama modülü (G’), bir numunenin strese nasıl tepki verdiğini (yani, orijinal şekline geri dönme yeteneğini) tanımlarken, viskoz veya kayıp modülü (G), sinüzoidal deformasyon döngüsü başına dağılan enerjiyi (yani, moleküllerin sürtünmesi nedeniyle kaybedilen enerjiyi) tanımlar. Karmaşık veya dinamik modül (G *), bir kesme yer değiştirmesine (yani, genel viskoelastik özelliklere) yanıt olarak iç kuvvet birikimi miktarını tanımlayan gerilmenin gerinimlere oranıdır. Sönümleme faktörü (bronz δ), viskoz modülün elastik modüle oranıdır, bu da bir numunenin enerjiyi dağıtma yeteneğini gösterir (yani, düşük bir bronzluk δ elastik-baskın / katı benzeri bir davranışı gösterirken, yüksek bir bronzluk δ viskoz-baskın / sıvı benzeri bir davranışı gösterir). Jel noktası özellikleri için, çapraz gerinim (γc), sapma yolunun kesme boşluğu yüksekliğine oranı ile hesaplanan, numunenin katı benzeri bir davranıştan sıvı benzeri bir davranışa geçtiği ve tanım gereği, G’ = G” veya bronzluk δ = 1 olduğu salınım geriniminde meydana geldiği kesme geriniminin ölçüsüdür. Çapraz akma gerilimi (σc), elastik ve viskoz modülün kesiştiği cihaz tarafından uygulanan gerilim miktarının bir ölçüsüdür. Sağlıklı balgamda, elastikiyet, gerinime karşı mekanik tepkiye hükmeder (G’ > G”). Muko-obstrüktif hastalıklarda, patolojik mukus değişiklikleri sonucu hem G’ hem de G” artışı17,18,19. Cihazın operasyonel basitliği, yerinde ölçümleri kolaylaştırır ve analiz için numune depolama/nakliye/tesis dışındaki bir tesise sevkiyat ihtiyacını ortadan kaldırır, böylece bu biyolojik numunelerin özellikleri üzerindeki zaman ve donma-çözülme etkilerini önler.
Bu çalışmada, ticari bir tezgah üstü reometrenin (Malzeme Tablosu) ölçüm aralığını doğrulamak için farklı konsantrasyonlarda (% 1-3) 8 MDa polietilen oksit (PEO) çözeltisi kullanılmış ve elde edilen konsantrasyona bağlı eğri, geleneksel bir dökme reometre (Malzeme Tablosu) ile elde edilen ölçümlerle doğrudan karşılaştırılmıştır. ). Reolojik ölçümlerin tekrarlanabilirliği daha sonra, çevresel veya enfeksiyöz bir ajana yanıt olarak bronkospazm, eozinofilik inflamasyon ve mukus hiperüretimi ile karakterize aşırı bir astım alevlenmesi formu olan status asthmaticus’tan (SA) muzdarip entübe edilmiş bir hastadan bronkoskopik olarak toplanan mukus kullanılarak değerlendirildi 8,20 . Bu olguda SA hastası ağır solunum yetmezliği nedeniyle entübe edilmiş ve agresif standart astım tedavilerine rağmen tek başına mekanik ventilasyon ile etkin ve güvenli bir şekilde desteklenememesi nedeniyle ECMO (ekstrakorporeal membran oksijenasyonu) gerekmiştir. Lober kollaps için klinik olarak endike olan bronkoskopi sırasında, kalın, berrak, inatçı sekresyonların lober bronşları tıkadığı kaydedildi ve salin yıkamaları kullanılarak aspire edildi. Toplandıktan hemen sonra, aspirattan fazla salin çıkarıldı ve kalan SA örneğinin viskoelastik özellikleri tezgah üstü cihaz kullanılarak analiz edildi. Ek örnek alikotlar, bu protokolün terapötik bileşik etkinliğini ex vivo olarak karakterize etmek için kullanılıp kullanılamayacağını belirlemek için bir indirgeyici ajan olan tris (2-karboksiletil) fosfin hidroklorür (TCEP) ile muamele edildi.
Sonuçlar, bu protokolün ve tezgah üstü cihazın klinik ortamda etkili bir şekilde kullanılabileceğini göstermiştir. PEO konsantrasyonuna bağımlı eğrilerden (Şekil 1A) belirlenen reolojik özellikler, test edilen tezgah üstü cihaz ile geleneksel paralel plaka reometresi (Şekil 1B) arasında ayırt edilemezdi. SA mukusunun üçlü ölçümleri, G *, G’ ve G” sonlanım noktaları için% 10’luk bir varyasyon katsayısı ile tekrarlanabilir ve bu hastanın olgusunda klinik olarak belirgin olan mukus viskoelastisitesindeki önemli anormallikleri yansıtıyordu (Şekil 1D). Son olarak, TCEP ile ex vivo tedavi, G’ ve G” de önemli bir azalma ve bronzluk δ bir artış ile sonuçlandı ve müsin ağındaki değişikliklerle tedaviye yanıt verdiğini gösterdi (Şekil 2). Sonuç olarak, tezgah üstü reometre kullanan bu protokol, klinikten elde edilen mukus örneklerinin viskoelastik özelliklerini değerlendirmek için basit ve etkili bir yaklaşım sunmaktadır. Bu yetenek, klinisyenler onaylanmış mukoaktif ilaçların etkinliğini yerinde test edebildiğinden, bakıma hassas tıp yaklaşımlarını kolaylaştırmak için kullanılabilir ve bu da alternatif tedavi seçeneklerinin belirlenmesine yardımcı olabilir. Ek olarak, bu yaklaşım araştırma ilaçlarının etkilerini incelemek için klinik çalışmalarda kullanılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mukusun eşsiz viskoelastik özellikleri, sağlıklı hava yollarının korunmasında esastır. İç ve dış faktörler hava yolu mukusunun biyofiziksel özelliklerini değiştirerek muko-obstrüktif hastalıkların karakteristik klinik komplikasyonlarına neden olabilir. Bu nedenle, mukus viskoelastisitesindeki değişikliklerin izlenmesi, hastalık durumunun değerlendirilmesi ve mukus viskoelastisitesini azaltan tedavilerin araştırılması sırasında düşünülebilir. 1980’lerden itibaren yapılan ampirik çalı?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu makale Vertex Pharmaceuticals (Ehre RIA Ödülü) ve CFF destekli Research EHRE20XX0 hibeleri ile desteklenmektedir.
Materials
| Capillary Pistons Tips | Gilson | CP1000 | |
| Discovery Hybrid Rheometer-3 | TA Instruments | DHR-3 Bulk Rheometer manufactured by TA Instruments in New Castle, DE: Used to preform rheological tests. |
|
| Graphing Software | GraphPad Prism | GraphPad Software (San Diego, CA) used for data analysis | |
| Microcentrifuge Tube | Costar | 3621 | |
| Peltier plate | TA Instruments | Temperature control system manufactured by TA Instruments in New Castle, DE |
|
| Polyethylene oxide | Sigma | 372838 | 8 MDa polymer used as mucus simulant |
| Positive Displacement Pipette | Gilson | M1000 | Pipette used for handling viscous solutions |
| Rheomuco | Rheonova | Benchtop Rheometer manufactured by Rheonova in France: Used to preform rheological tests. | |
| Rough Lower Geometries | Rheonova | D-1811-007 | 25mm Diameter |
| Rough Upper Geometries | Rheonova | U-1811-007 | 25mm Diameter |
| Smooth Upper Parallel Plate | TA Instruments | 20mm Diameter | |
| tris(2-carboxyethyl)phosphine | Sigma | 646547-10X1ML | TCEP: Potent reducing agent. |
References
- Button, B., et al. A periciliary brush promotes the lung health by separating the mucus layer from airway epithelia. Science. 337 (6097), 937-941 (2012).
- Boucher, R. C. Muco-obstructive lung diseases. New England Journal of Medicine. 380 (20), 1941-1953 (2019).
- Rose, M. C., Voynow, J. A. Respiratory tract mucin genes and mucin glycoproteins in health and disease. Physiological Reviews. 86 (1), 245-278 (2006).
- Ehre, C., Ridley, C., Thornton, D. J. Cystic fibrosis: An inherited disease affecting mucin-producing organs. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 52, 136-145 (2014).
- Morrison, C. B., Markovetz, M. R., Ehre, C. Mucus, mucins, and cystic fibrosis. Pediatric Pulmonology. 54, 84-96 (2019).
- Hill, D. B., Button, B., Rubinstein, M., Boucher, R. C. Physiology and Pathophysiology of Human Airway Mucus. Physiological Reviews. , (2022).
- Lin, V. Y., et al. Excess mucus viscosity and airway dehydration impact COPD airway clearance. European Respiratory Journal. 55 (1), 1900419 (2020).
- Fahy, J. V., Dickey, B. F. Airway mucus function and dysfunction. The New England Journal of Medicine. 363 (23), 2233-2247 (2010).
- Tomaiuolo, G., et al. A new method to improve the clinical evaluation of cystic fibrosis patients by mucus viscoelastic properties. PloS One. 9 (1), 82297 (2014).
- Shak, S., Capon, D. J., Hellmiss, R., Marsters, S. A., Baker, C. L. Recombinant human DNase I reduces the viscosity of cystic fibrosis sputum. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (23), 9188-9192 (1990).
- Zahm, J. M., et al. Dose-dependent in vitro effect of recombinant human DNase on rheological and transport properties of cystic fibrosis respiratory mucus. The European Respiratory Journal. 8 (3), 381-386 (1995).
- Fuchs, H. J., et al. Effect of aerosolized recombinant human DNase on exacerbations of respiratory symptoms and on pulmonary function in patients with cystic fibrosis. The Pulmozyme Study Group. The New England Journal of Medicine. 331 (10), 637-642 (1994).
- Hubbard, R. C., et al. A preliminary study of aerosolized recombinant human deoxyribonuclease I in the treatment of cystic fibrosis. The New England Journal of Medicine. 326 (12), 812-815 (1992).
- Shak, S. Aerosolized recombinant human DNase I for the treatment of cystic fibrosis. Chest. 107, 65-70 (1995).
- Ma, J. T., Tang, C., Kang, L., Voynow, J. A., Rubin, B. K. Cystic fibrosis sputum rheology correlates with both acute and longitudinal changes in lung function. Chest. 154 (2), 370-377 (2018).
- Donaldson, S. H., et al. Mucus clearance and lung function in cystic fibrosis with hypertonic saline. The New England Journal of Medicine. 354 (3), 241-250 (2006).
- Patarin, J., et al. Rheological analysis of sputum from patients with chronic bronchial diseases. Scientific Reports. 10 (1), 15685 (2020).
- Markovetz, M. R., et al. Endotracheal tube mucus as a source of airway mucus for rheological study. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 317 (4), 498-509 (2019).
- Ramsey, K. A., et al. Airway mucus hyperconcentration in non-cystic fibrosis bronchiectasis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 201 (6), 661-670 (2020).
- Dunican, E. M., et al. Mucus plugs in patients with asthma linked to eosinophilia and airflow obstruction. The Journal of Clinical Investigation. 128 (3), 997-1009 (2018).
- Ehre, C., et al. An improved inhaled mucolytic to treat airway muco-obstructive diseases. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 199 (2), 171-180 (2019).
- Morrison, C. B., et al. Treatment of cystic fibrosis airway cells with CFTR modulators reverses aberrant mucus properties via hydration. The European Respiratory Journal. 59 (2), 2100185 (2021).
- Puchelle, E., Jacquot, J., Beck, G., Zahm, J. M., Galabert, C. Rheological and transport properties of airway secretions in cystic fibrosis-relationships with the degree of infection and severity of the disease. European Journal of Clinical Investigation. 15 (6), 389-394 (1985).
- Puchelle, E., Zahm, J. M., Quemada, D. Rheological properties controlling mucociliary frequency and respiratory mucus transport. Biorheology. 24 (6), 557-563 (1987).
- Cardinaels, R., Reddy, N. K., Clasen, C. Quantifying the errors due to overfilling for Newtonian fluids in rotational rheometry. Rheologica Acta. 58 (8), 525-538 (2019).
- Hancock, L. A., et al. Muc5b overexpression causes mucociliary dysfunction and enhances lung fibrosis in mice. Nature Communications. 9 (1), 5363 (2018).
- Adewale, A. T., et al. Novel therapy of bicarbonate, glutathione, and ascorbic acid improves cystic fibrosis mucus transport. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 63 (3), 362-373 (2020).
- Fernandez-Petty, C. M., et al. A glycopolymer improves vascoelasticity and mucociliary transport of abnormal cystic fibrosis mucus. JCI Insight. 4 (8), 125954 (2019).
