Induction d’une inflammation de la surface oculaire et collecte de tissus impliqués
Summary
L’inflammation de la surface oculaire endommage les tissus de la surface oculaire et compromet les fonctions vitales de l’œil. Le présent protocole décrit une méthode pour induire une inflammation oculaire et recueillir des tissus compromis dans un modèle murin de dysfonctionnement de la glande de Meibomius (MGD).
Abstract
Les maladies de la surface oculaire comprennent une gamme de troubles qui perturbent les fonctions et les structures de la cornée, de la conjonctive et du réseau de glandes de surface oculaire associé. Les glandes de Meibomius (MG) sécrètent des lipides qui créent une couche de couverture qui empêche l’évaporation de la partie aqueuse du film lacrymal. Les neutrophiles et les pièges à ADN extracellulaire peuplent la MG et la surface oculaire dans un modèle murin de maladie oculaire allergique. Les pièges extracellulaires agrégés de neutrophiles (aggNETs) forment une matrice en forme de maille composée de chromatine extracellulaire qui obstrue les sorties de MG et conditionne le dysfonctionnement de MG. Ici, une méthode pour induire une inflammation de la surface oculaire et un dysfonctionnement MG est présentée. Les procédures de collecte des organes liés à la surface oculaire, tels que la cornée, la conjonctive et les paupières, sont décrites en détail. En utilisant des techniques établies pour le traitement de chaque organe, les principales caractéristiques morphologiques et histopathologiques du dysfonctionnement MG sont également montrées. Les exsudats oculaires offrent la possibilité d’évaluer l’état inflammatoire de la surface oculaire. Ces procédures permettent d’étudier des interventions anti-inflammatoires topiques et systémiques au niveau préclinique.
Introduction
Chaque clignement d’œil reconstitue le film lacrymal lisse dispersé sur la cornée. L’épithélium de la surface oculaire facilite la distribution et l’orientation correcte du film lacrymal sur la surface oculaire. Les mucines sont fournies par la cornée et les cellules épithéliales conjonctives pour aider à positionner la partie aqueuse du film lacrymal provenant des glandes lacrymales à la surface des yeux. Enfin, le MG sécrète des lipides qui créent une couche de revêtement qui empêche l’évaporation de la partie aqueuse du film lacrymal 1,2,3. De cette façon, les fonctions coordonnées de tous les organes oculaires protègent la surface oculaire contre les agents pathogènes envahissants ou les blessures et soutiennent une vision cristalline sans douleur ni inconfort.
Dans une surface oculaire saine, la décharge oculaire ou le rheum oculaire balaye la poussière, les cellules épithéliales mortes, les bactéries, le mucus et les cellules immunitaires. Les pièges extracellulaires agrégés de neutrophiles (aggNETs) formulent une matrice en forme de maille composée de chromatine extracellulaire et incorporent ces composants dans le rhume oculaire. Les TNEG résolvent l’inflammation par la dégradation protéolytique des cytokines pro-inflammatoires et des chimiokines4. Cependant, lorsqu’elles deviennent dysfonctionnelles, ces aggNET aberrantes entraînent la pathogenèse de maladies telles que les occlusions vasculaires dans COVID-195, les calculs biliaires6 et la sialolithiase7. De même, les aggNET sur la surface oculaire jouent un rôle protecteur et contribuent à résoudre l’inflammation de la surface fortement exposée8. Une formation exagérée ou l’absence d’aggNET dans la surface oculaire peut altérer la stabilité du film lacrymal et / ou causer des plaies cornéennes, une conjonctivite cicatrisante et une sécheresse oculaire. Par exemple, l’obstruction de la MG est l’une des principales causes de sécheresse oculaire9. Les AggNET sont également connus pour boucher le flux de sécrétion lipidique des canaux de MG et provoquer un dysfonctionnement de la glande de Meibomius (MGD). La congestion des orifices MG par les AGGNET provoque un manque de liquide gras enveloppant la surface oculaire et un liquide embouteillé rétrograde, entraînant un dysfonctionnement de la fonction glandulaire et des lésions acineuses. Ce dysfonctionnement peut entraîner l’évaporation du film lacrymal, la fibrose des marges sur les paupières, l’inflammation des yeux et des dommages néfastes au MG10,11.
Plusieurs modèles animaux ont été développés au fil des ans pour imiter le processus pathologique de MGD chez l’homme. Par exemple, des souris C57BL/6 âgées de 1 an ont aidé à étudier les effets liés à l’âge sur la sécheresse oculaire (DED) et la MGD, reflétant la pathologie de la maladie oculaire chez les patients âgés de 50 ans et plus12,13,14. En outre, les lapins sont des modèles appropriés pour étudier les effets des interventions pharmacologiques. Par conséquent, l’induction de MGD chez le lapin a été rapportée soit par l’administration topique d’épinéphrine, soit par l’introduction systémique d’acide 13-cis-rétinoïque (isotrétinoïne)15,16,17,18,19.
Bien que ces modèles animaux aient été adéquats pour déterminer les différents facteurs contribuant à la physiopathologie de la MGD, leur utilisation a été limitée. Par exemple, le modèle murin de MGD liée à l’âge était idéal pour déchiffrer des éléments chez les personnes âgées seulement, et par conséquent, les lapins semblaient être le modèle animal le plus approprié pour étudier les maladies de la surface oculaire, car ils permettent l’étude de multiples mécanismes physiopathologiques. Cependant, en raison du manque d’outils analytiques complets pour détecter les protéines à la surface oculaire et parce que de nombreuses parties du génome du lapin ne sont pas annotées, elles sont limitées pour les recherches20,21.
De plus, ces modèles animaux utilisés pour étudier la pathogenèse de la sécheresse oculaire n’ont pas fourni suffisamment de détails pour analyser le bras immunologique de la maladie qui provoque l’inflammation de la surface oculaire. En conséquence, le modèle murin de MGD développé par Reyes et al. a montré une association entre la maladie oculaire allergique chez la souris et la MGD chez l’homme et a mis en évidence l’étiologie immunitaire responsable de MGD21 obstructif. Ce modèle associe la maladie oculaire allergique à une réponse TH17 qui recrute des neutrophiles à la conjonctive et à la paupière, provoquant MGD et inflammation oculaire chronique21. L’induction de MGD et d’inflammation oculaire dans ce modèle murin est un outil précieux pour étudier les événements en amont lors du développement d’une inflammation locale entraînée par une réponse immunitaire continue21. Le protocole actuel décrit l’inflammation de la surface oculaire accompagnée d’une MGD obstructive. Dans cette méthode, les souris sont immunisées et, après 2 semaines, défiées sur la surface oculaire avec l’immunogène pendant 7 jours. En outre, les étapes pour isoler l’exsudat oculaire et les organes oculaires associés lors de l’inflammation aiguë et de la dissection de la cornée, de la conjonctive et des paupières sont décrites.
Protocol
Representative Results
Discussion
La sécrétion huileuse des glandes de Meibomius est d’une grande importance pour un œil sain22. Cependant, l’obstruction de ces glandes sébacées par des pièges extracellulaires agrégés de neutrophiles (aggNETs) qui s’alignent sous forme de brins parallèles situés sur les plaques tarsiennes des deux paupières peut perturber le filmlacrymal 23. Cette perturbation entraîne un dysfonctionnement de la glande de Meibomius (MGD)1 et une év…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été partiellement soutenu par la Fondation allemande pour la recherche (DFG) 2886 PANDORA Project-No.B3; SCHA 2040/1-1; MU 4240/2-1; CRC1181(C03); TRR241(B04), H2020-FETOPEN-2018-2020 Project 861878, et par la Volkswagen-Stiftung (subvention 97744) à MH.
Materials
| 1x PBS | Gibco | ||
| Aluminium Hydroxide | Imject alum Adjuvant | 77161 | 40 mg/ mL Final Concentration: in vivo: 1 mg/ 100 µL |
| C57Bl/6 mice, aged 7–9 weeks | Charles River Laboratories | ||
| Calcium | Carl roth | CN93.1 | 1 M Final Concentration: 5 mM |
| Curved forceps | FST by Dumont SWITZERLAND | 5/45 11251-35 | |
| Fine sharp scissor | FST Stainless steel, Germany | 15001-08 | |
| Laminar safety cabinet | Herasafe | ||
| Macrophotography Camera | Canon | EOS6D | |
| Macrophotography Camera (without IR filter) | Nikon | D5300 | |
| Mnase | New England biolabs | M0247S | 2 x 106 gel U/mL |
| Multi-analyte flow assay kit (Custom mouse 13-plex panel) | Biolegend | CLPX-200421AM-UERLAN | |
| NaCl 0,9% (Saline) | B.Braun | ||
| Ovalbumin (OVA) | Endofit, Invivogen | 9006-59-1 | 10 mg/200 µL in saline |
| Pertussis toxin | ThermoFisher Scientific | PHZ1174 | 50 µg/ 500 µL in saline Final Concentration: in vivo: 100 µg/ 100 µL |
| Petridish | Greiner bio-one | 628160 | |
| Scalpel | Feather disposable scalpel | No. 21 | Final Concentration: in vivo: 300 ng/ 100 µL |
| Stereomicroscope | Zaiss | Stemi508 | |
| Syringe (corneal/iris washing) | BD Microlane | 27 G x 3/4 – Nr.20 0,4 x 19 mm | |
| Syringe (i.p immunization) | BD Microlane | 24 G1"-Nr 17, 055* 25 mm |
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