Brug af mikrofluidik og fluorescensmikroskopi til at studere samlingsdynamikken i enkeltaktinfilamenter og bundter
Summary
Vi præsenterer protokoller for enkle actinfilamentmikrofluidiske assays i kombination med fluorescensmikroskopi, der gør det muligt for en nøjagtigt at overvåge individuelle actinfilamenter i realtid, mens de sekventielt udsættes for forskellige proteinopløsninger.
Abstract
For at dechiffrere de komplekse molekylære mekanismer, der regulerer samlingen og demonteringen af actinfilamenter, er det et stort aktiv at overvåge individuelle reaktioner lever under velkontrollerede forhold. For at gøre dette er der opstået levende enkeltfilamenteksperimenter i løbet af de sidste 20 år, hovedsagelig ved hjælp af TIRF-mikroskopi (total internal reflection fluorescens), og har givet en række nøgleresultater. I 2011 introducerede vi enkle mikrofluidik i disse assays for yderligere at udvide mulighederne for disse eksperimenter og for at undgå tilbagevendende problematiske artefakter. Denne undersøgelse beskriver vores grundlæggende protokol, hvor individuelle actinfilamenter er forankret i den ene ende til den passiverede dækslipoverflade, justeres med strømmen og successivt kan udsættes for forskellige proteinopløsninger. Vi præsenterer også protokollerne til specifikke applikationer og forklarer, hvordan kontrollerede mekaniske kræfter kan påføres takket være den viskøse træk i den flydende opløsning. Vi fremhæver de tekniske forbehold i disse eksperimenter og præsenterer kort mulige udviklinger baseret på denne teknik. Disse protokoller og forklaringer sammen med nutidens tilgængelighed af brugervenligt mikrofluidikudstyr bør give ikke-specialister mulighed for at implementere dette assay i deres laboratorier.
Introduction
Samlingen og demonteringen af actinfilamenter og actinfilamentnetværk styres af flere biokemiske reaktioner og afhænger af den mekaniske kontekst. For at få indsigt i disse komplekse mekanismer er det uvurderligt at kunne observere individuelle reaktioner på individuelle filamenter (i tilstrækkeligt stort antal). I løbet af de sidste årtier har observation af dynamiske actinfilamenter i realtid, hovedsagelig ved hjælp af tirf-mikroskopi (Total Internal Reflection Fluorescence), vist sig som en nøgleteknik og har givet en imponerende liste over resultater, der ikke kunne have været opnået med biokemiske analyser i bulkopløsning1.
For at opnå dette skal man opretholde fluorescerende mærkede actinfilamenter tæt på overfladen af mikroskopdækslet, mens man udsætter dem for opløsninger af actinbindende proteiner (ABP’er), som også kan mærkes fluorescerende. Dette giver et middel til at overvåge begivenheder, der finder sted på individuelle filamenter under velkontrollerede biokemiske forhold, og dermed kvantificere reaktionshastigheder. Der bør dog overvejes en række specifikke begrænsninger. Kunstig vedligeholdelse af filamenter tæt på overfladen, ofte takket være flere forankringspunkter eller ved hjælp af et trængselsmiddel såsom methylcellulose, kan ændre deres adfærd (f.eks. Forårsage pauser i deres polymerisation og depolymerisering2). Sporing af konturen af hvert filament kan være udfordrende, især hvis nye filamenter eller filamentfragmenter akkumuleres i synsfeltet over tid. Reaktionerne finder sted i et endeligt volumen, hvor koncentrationen af actinmonomerer og ABP’er kan variere over tid, hvilket potentielt gør det vanskeligt at udlede nøjagtige hastighedskonstanter. Endelig er det vanskeligt at forny eller ændre opløsningen af ABP’er på mindre end 30 s og vil ofte føre til inhomogent proteinindhold i prøven.
For lidt over 10 år siden, inspireret af hvad der allerede blev gjort for at studere individuelle Deoxyribonukleinsyre (DNA) tråde3, introducerede vi en ny teknik baseret på mikrofluidik til at observere og manipulere individuelle actinfilamenter4. Det giver en mulighed for at omgå de førnævnte begrænsninger af klassiske enkeltfilamentteknikker. I disse mikrofluidiske assays dyrkes actinfilamenter fra spectrin-actinfrø adsorberet på dækslippen. Filamenter er således forankret i den ene ende kun til bunden af det mikrofluidiske kammer og svinger over overfladen uden at klæbe. Filamenter flugter med strømmen af indgående opløsninger, hvorved overvågningen af deres konturlængde lettes, og de opretholdes i et lavt område over dækslen, hvor TIRF kan anvendes. Forskellige opløsninger strømmer samtidig ind i kammeret uden blanding, og filamenterne kan udsættes for dem sekventielt og hurtigt.
Her foreslår vi en række grundlæggende protokoller til opsætning af enkelt-actin-filament mikrofluidik-assays i laboratoriet. Dækslips og mikrofluidikkamre kan fremstilles på forhånd (om en halv dag), og selve eksperimentet, hvor flere biokemiske forhold kan testes, udføres på mindre end en dag.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sammenlignet med standard enkeltfilamentmetoder, hvor actinfilamenter forankres til overfladen med flere punkter langs deres længde eller opretholdes tæt på den af et trængselsmiddel såsom methylcellulose, giver mikrofluidik en række fordele. Da interaktioner med overfladen er minimale, undgås de kunstige pauser, som disse interaktioner kan fremkalde under både forlængelse og depolymerisering. Filamenterne er justeret af strømmen parallelt med hinanden, hvilket letter deres overvågning og måling af deres læn…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi er taknemmelige for B. Ladoux og R.-M. Mège lab for brugen af deres UV-renere udstyr, og J. Heuvingh og 0. du Roure for den indledende træning, vi modtog om forberedelse af forme på siliciumskiver og give tip til mikrofluidik. Vi anerkender finansiering fra European Research Council Grant StG-679116 (til AJ) og Agence Nationale de la Recherche Grants Muscactin og Conformin (til G.R.-L.).
Materials
| β-Casein | Merck | C6905 | Used at 8 mg/mL |
| Biopsy punch (with plunger) | Ted Pella | 15115-2 | ID 0.75 mm, OD 1.07 mm |
| Biotin-BSA | Merck | A8549 | Used at 1 mg/mL |
| BSA | Merck | A8022 | Used at 50 mg/mL |
| Coverslip Mini-Rack Teflon holder |
Invitrogen | C14784 | for 8 coverslips |
| Coverslips 22x40mm Thickness #1.5 |
Menzel Gläser | 631-1370 | |
| DABCO | Merck | D27802 | component in f-buffer |
| DTT | Euromedex | EU0006-D | component in f-buffer |
| Ester NHS Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A20000 | Fluorophore for actin labeling on Lys328. |
| EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin | Thermo Scientific | 21338 | To biotinylate actin on Lys328 |
| Hellmanex III | Hellma | 9-307-011-4-507 | Glass cleaning detergent |
| ImageJ | NIH | N/A | open source software |
| Laboport | KNF | 811kn.18 | vacuum pump (ultimate vacuum: 240 mbar) |
| Magic invisible tape | Scotch | 7100024666 | standard transparent office tape |
| Micrewtube | Simport | T341-6T | 2 mL microfluidic reservoir tubes |
| Microfluidic device Part 1: Flow Unit S | Fluigent | FLU-S-D-PCKB | Flowmeter |
| Microfluidic device Part 2: Fluiwell-4C-2 mL | Fluigent | 14002001PCK | Reservoir holder |
| Microfluidic device Part 3: MFCS-EZ | Fluigent | EZ-11000001 EZ-00345001 |
Pressure controller |
| Model 42 – UVO-Cleaner | Jelight Inc. | 42-220 | Ultraviolet cleaner |
| N6-(6-Aminohexyl)-ATP-ATTO-488 | Jena Bioscience | NU-805-488 | ATP-ATTO used to label actin |
| neutravidin | Thermo Scientific | 31000 | |
| PLL-PEG | SuSoS | PLL(20)-g[3.5]- PEG(2) | Use at 1 mg/mL in PBS. |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) Sylgard 184 Silicon Elastomer | Dow Corning | 1673921 | Contains PDMS base and curing agent |
| Polyetheretherketone (PEEK) tubing | Merck | Z226661 | “Blue” : I.D. = 0.25 mm |
| Safety blow gun | Coilhose Pneumatics | 700-S | filtered air |
| Silicon tubing | VWR | 228-0701P | connect PEEK to coupler |
| Stainless steel catheter coupler | Prime Bioscience | SC22/15 | Inserted into PDMS inlets and outlet to connect to PEEK tubing |
| Thermoplastic film | Sigma Aldrich | PM996 | Standard "parafilm" |
| Ultrapure ethanol | VWR | 64-17-5 | |
| Ultrasonic cleaning bath | VWR | USC200TH | To accomodate 1 L beakers |
| Vacuum dessicator | SP Bel-Art | F42022-0000 | to degas the PDMS or solutions |
References
- Wioland, H., Jégou, A., Romet-Lemonne, G. Celebrating 20 years of live single-actin-filament studies with five golden rules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (3), 2109506119 (2022).
- Kuhn, J. R., Pollard, T. D. Real-time measurements of actin filament polymerization by total internal reflection fluorescence microscopy. Biophysical Journal. 88 (2), 1387-1402 (2005).
- Brewer, L. R., Bianco, P. R. Laminar flow cells for single-molecule studies of DNA-protein interactions. Nature Methods. 5 (6), 517-525 (2008).
- Jégou, A., et al. Individual actin filaments in a microfluidic flow reveal the mechanism of ATP hydrolysis and give insight into the properties of profilin. PLoS Biology. 9 (9), 1001161 (2011).
- Gicquel, Y., et al. Microfluidic chips for in situ crystal x-ray diffraction and in situ dynamic light scattering for serial crystallography. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57133 (2018).
- Chandradoss, S. D., et al. Surface passivation for single-molecule protein studies. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (86), e50549 (2014).
- Schaedel, L., et al. Microtubules self-repair in response to mechanical stress. Nature Materials. 14 (11), 1156-1163 (2015).
- Zimmermann, D., Morganthaler, A. N., Kovar, D. R., Suarez, C. In vitro biochemical characterization of cytokinesis actin-binding proteins. Methods in Molecular Biology. 1369, 151-179 (2016).
- Funk, J., et al. Profilin and formin constitute a pacemaker system for robust actin filament growth. eLife. 8, 50963 (2019).
- Pandit, N. G., et al. Force and phosphate release from Arp2/3 complex promote dissociation of actin filament branches. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (24), 13519-13528 (2020).
- Wioland, H., et al. ADF/Cofilin accelerates actin dynamics by severing filaments and promoting their depolymerization at both ends. Current Biology: CB. 27 (13), 1956-1967 (2017).
- Pollard, T. D., Mooseker, M. S. Direct measurement of actin polymerization rate constants by electron microscopy of actin filaments nucleated by isolated microvillus cores. The Journal of Cell Biology. 88 (3), 654-659 (1981).
- Kovar, D. R., Harris, E. S., Mahaffy, R., Higgs, H. N., Pollard, T. D. Control of the assembly of ATP- and ADP-actin by formins and profilin. Cell. 124 (2), 423-435 (2006).
- Jégou, A., Carlier, M. -. F., Romet-Lemonne, G. Formin mDia1 senses and generates mechanical forces on actin filaments. Nature Communications. 4, 1883 (2013).
- Breitsprecher, D., et al. Rocket launcher mechanism of collaborative actin assembly defined by single-molecule imaging. Science. 336 (6085), 1164-1168 (2012).
- Courtemanche, N., Lee, J. Y., Pollard, T. D., Greene, E. C. Tension modulates actin filament polymerization mediated by formin and profilin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (24), 9752-9757 (2013).
- Niedermayer, T., et al. Intermittent depolymerization of actin filaments is caused by photo-induced dimerization of actin protomers. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (27), 10769-10774 (2012).
- Gateva, G., et al. Tropomyosin isoforms specify functionally distinct actin filament populations in vitro. Current Biology: CB. 27 (5), 705-713 (2017).
- Aratyn, Y. S., Schaus, T. E., Taylor, E. W., Borisy, G. G. Intrinsic dynamic behavior of fascin in filopodia. Molecular Biology of the Cell. 18 (10), 3928-3940 (2007).
- Pollard, T. D. Rate constants for the reactions of ATP- and ADP-actin with the ends of actin filaments. The Journal of Cell Biology. 103, 2747-2754 (1986).
- Wioland, H., Jegou, A., Romet-Lemonne, G. Torsional stress generated by ADF/cofilin on cross-linked actin filaments boosts their severing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (7), 2595-2602 (2019).
- Colombo, J., et al. A functional family of fluorescent nucleotide analogues to investigate actin dynamics and energetics. Nature Communications. 12 (1), 548 (2021).
- Spudich, J. A., Watt, S. The regulation of rabbit skeletal muscle contraction. I. Biochemical studies of the interaction of the tropomyosin-troponin complex with actin and the proteolytic fragments of myosin. The Journal of Biological Chemistry. 246 (15), 4866-4871 (1971).
- Romet-Lemonne, G., Guichard, B., Jégou, A. Using microfluidics single filament assay to study formin control of actin assembly. Methods in Molecular Biology. 1805, 75-92 (2018).
- Gieselmann, R., Kwiatkowski, D. J., Janmey, P. A., Witke, W. Distinct biochemical characteristics of the two human profilin isoforms. European Journal of Biochemistry. 229 (3), 621-628 (1995).
- Lin, D. C., Lin, S. Actin polymerization induced by a motility-related high-affinity cytochalasin binding complex from human erythrocyte membrane. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (5), 2345-2349 (1979).
- Casella, J. F., Maack, D. J., Lin, S. Purification and initial characterization of a protein from skeletal muscle that caps the barbed ends of actin filaments. The Journal of Biological Chemistry. 261 (23), 10915-10921 (1986).
- Kremneva, E., et al. Cofilin-2 controls actin filament length in muscle sarcomeres. Developmental Cell. 31 (2), 215-226 (2014).
- Le Clainche, C., Carlier, M. -. F. Actin-based motility assay. Current Protocols in Cell Biology. , 1-20 (2004).
- Vignjevic, D., et al. Formation of filopodia-like bundles in vitro from a dendritic network. The Journal of Cell Biology. 160 (6), 951-962 (2003).
- Duellberg, C., Cade, N. I., Holmes, D., Surrey, T. The size of the EB cap determines instantaneous microtubule stability. eLife. 5, 13470 (2016).
- Duellberg, C., Cade, N. I., Surrey, T. Microtubule aging probed by microfluidics-assisted tubulin washout. Molecular Biology of the Cell. 27 (22), 3563-3573 (2016).
- Suzuki, E. L., et al. Geometrical constraints greatly hinder formin mDia1 activity. Nano Letters. 20 (1), 22-32 (2020).
- Wioland, H., Suzuki, E., Cao, L., Romet-Lemonne, G., Jegou, A. The advantages of microfluidics to study actin biochemistry and biomechanics. Journal of Muscle Research and Cell Motility. 41 (1), 175-188 (2020).
