이 프로토콜은 크기 배제 크로마토그래피, 배양 상청액으로부터 Mycobacterium tuberculosis 세포밖 소포를 풍부하게하기 위한 용이하고 재현 가능한 기술을 기술한다.
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이 논문에서
요약
초록
박테리아 감염의 맥락에서 세포 밖 소포 (EVs)의 역할은 미생물 생리학을 이해하기위한 새로운 길로 부상했습니다. 구체적으로, 결핵균 (Mtb) EVs는 숙주-병원체 상호작용 및 환경 스트레스에 대한 반응에서 역할을 한다. Mtb EV는 또한 항원성이 높으며 백신 성분으로서의 잠재력을 보여줍니다. Mtb EV를 정제하는 가장 일반적인 방법은 밀도 구배 초원심분리입니다. 이 프로세스에는 낮은 처리량, 낮은 수율, 고가의 장비에 대한 의존도, 기술적 과제 등 몇 가지 제한 사항이 있으며 결과 준비에 부정적인 영향을 줄 수 있습니다. 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)는 초원심분리의 많은 한계에 대처하는 온화한 대안 방법입니다. 이 프로토콜은 SEC가 Mtb EV 농축에 효과적이며 신속하고 확장 가능한 방식으로 수율 증가의 고품질 Mtb EV 제제를 생산한다는 것을 보여줍니다. 또한, 정량화 및 검증 절차에 의한 밀도 구배 초원심분리와의 비교는 SEC의 이점을 입증합니다. EV 수량 (나노입자 추적 분석), 표현형 (투과 전자 현미경) 및 함량 (웨스턴 블롯팅)의 평가는 Mtb EV에 맞게 조정되지만 제공된 워크 플로는 다른 마이코 박테리아에 적용될 수 있습니다.
서론
병원균에 의한 세포밖 소포(EV) 방출은 감염성 질환을 통제하기 위한 새로운 기술을 잠금 해제하는 열쇠가 될 수 있다1. Mycobacterium tuberculosis (Mtb)는 세계 인구의 약 삼분의 일을 감염시키고 매년 수백만 명의 사람들의 생명을 앗아가는 높은 결과의 병원체입니다2. Mtb에 의한 EV 생산은 감염 3,4,5의 맥락에서 이들 EVs의 생물발생 및 다양한 역할(즉, 면역자극성, 면역억제, 철분 및 영양소 획득)에서 애매하면서도 잘 문서화되어 있다. Mtb EVs의 조성을 이해하려는 노력은 면역학적 유의성의 지질 및 단백질을 함유하는 원형질막으로부터 유래된 50-150 nm 지질막-밀폐된 구체를 밝혀냈다 3,6. 박테리아 생리학에서 Mtb EVs의 역할에 대한 조사는 생존을 위한 환경 스트레스에 반응하여 박테리아 EV 조절의 중요성을 밝혀냈다 5. 숙주-병....
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프로토콜
콜로라도 주립 대학 기관 생물 안전위원회는 본 연구를 승인했다 (19-046B). Mycobacterium tuberculosis 의 배양과 EV가 풍부한 배양 상청액의 수확은 높은 격리 실험실에서 훈련 된 인력에 의해 수행되었습니다. 이 물질은 유효한 불활성화 방법이 수행되고, 확인되고, 제도적 생물 안전 정책에 의해 승인 된 후 높은 봉쇄 구역 밖으로 옮겨졌습니다. 프로토콜을 복제하는 동안 검증된 불활성화 또는 멸균 여과 방법이 실현 가능하지 않은 경우 다음 절차를 높은 격리 실험실에서 수행해야 합니다.
1. 조질 Mtb EV 농축액의 제조
참고: Mtb 배양 및 배양 여액 단백질(CFP)의 제조에 대한 자세한 절차는 참고문헌11,12를 참조하십시오. 박테리아 배양 배지는 올레산 알부민 덱스트로스 카탈라아제 (OADC)와 같은 EV 함유 또는 단백질 성분 및 트윈과 같은 세제를 함유 한 성장 보충제가없는 것이 좋습니다. 또한 박테리아 배양물의 품질 및 수확된 CFP를 선별하여 제한된 세포 사멸 및 용해13,14<....
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결과
결핵균(Mtb)으로부터 배양여액 단백질(CFP)을 농축, 정량한 다음, 물질 3 mg을 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 컬럼에 적용하였다. 단백질 및 입자 농도를 각각 BCA 및 NTA로 열거하였다. 단백질 및 입자 회수에 대한 예상 범위와 이러한 결과에 대해 수득된 정확한 값이 표 1에 보고되어 있다. 이러한 범위보다 훨씬 높은 값은 오염 또는 컬럼 무결성 문제를 나타낼 수 있습니다. 값은 한외여과 단계에서 상당히 낮은 문제점을 가리키며, 따라서 유동-스루는 성공적인 농도가 발생했는지를 결정하기 위해 출발 CFP 및 100R과 비교될 필요가 있다. 비특이적 단백질 실버-염색은 이후 분획이 더 많은 단백질을 함유하고 100R 물질과 유사하다는 것을 보여준다(그림 1).
분획의 웨스턴 블롯은 리포아라비노만난(LAM)이 분획에 걸쳐 존재한다는 것을 입증하며, 이후 분획은 더 낮은 강.......
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토론
마이코박테리움 결핵 세포밖 소포는 항원성이 높은 저장소로, 진단 도구 및 미래 백신 4,19,20 개발을 위한 매력적인 길로 제시됩니다. 역사적으로, 밀도 구배 초원심분리는 Mtb EV를 다른 용해성, 분비 물질(8)로부터 분리하는데 사용되어 왔다. 이 공정은 효과적이지만, 또한 시간이 많이 걸리고, 기술적으로 도전적이며, 결과적인 EV 제제(9,10)의 무결성에 영향을 미칠 수 있다. 제시된 프로토콜은 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)를 통해 Mtb EV 제제에 대한 대안적인 방법을 제공한다.
이 방법에는 성공을위한 몇 가지 중요한 포인트가 있습니다.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
우리는 수의학 및 생물 의학 과학 체험 상 및 대학 연구위원회 공유 연구 프로그램의 지원을 NKG에 지원하고 ATCC (상 # 2016-0550-0002)가 KMD에 자금을 지원한다는 것을 인정하고 싶습니다. 우리는 또한 Anne Simpson에게 기술 지원 및 BEI Resources, NIAID, NIH의 다음 시약을 인정하고 싶습니다 : 모노클로날 항 마이코박테리움 결핵 LpqH (유전자 Rv3763), IT-54 (시험관 내에서 생산), NR-13792, 모노클로날 항 마이코박테리움 결핵 GroES (유전자 Rv3418c), 클론 IT-3 (SA-12) (시험관 내에서 생산), NR-49223 및 모노클로날 항 마이코박테리움 결핵 LAM, 클론 CS-35 (시험관 내에서 생산), NR-13811.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 20x MES SDS Running Buffer | ThermoFisher Scientific | NP0002 | |
| 96웰 플레이트 | Corning | 15705-066 | |
| 자동 분획 분취기 | IZON Science | AFC-V1-USD | |
| BenchMark Pre-stained Protein Ladder | Invitrogen | 10748010 | |
| Benchtop 원심분리기 | Beckman Coulter | Allegra 6R | |
| Centricon Plus - 70 원심 필터, 100 kDa 차단 | Millipore Sigma | UFC710008 | 1.1단계에서 사용되는 한외여과 장치 |
| 전기블로팅 시스템 | ThermoFisher Scientific | 09-528-135 | |
| EM 등급 파라포름알데히드 | 전자 현미경 Sciences | 15714-S | |
| Formvar/Carbon 200 mesh Cu Grids | 전자 현미경 과학 | FCF200H-Cu-TA | |
| 염소 안티 마우스 IgG H& L (알칼리성 포스파타제), 전분자, 1 mL | AbCam | ab6790 | 2차 항체 |
| JEM-1400 투과 전자 현미경 | JOEL | ||
| Micro BCA 단백질 분석 키트 | ThermoFisher Scientific | 23235 | |
| 마이크로플레이트 리더 | BIOTEK | Epoch | |
| Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis GroES (Gene Rv3814c) | BEI Resources | NR-49223 | 1차 항체 |
| 단클론 항Mycobacterium tuberculosis LpqH (Gene Rv3763) | BEI Resources | NR-13792 | 1차 항체 |
| Monocolonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LAM, 클론 CS-35 | BEI Resources | NR-13811 | 1차 항체 |
| NanoClean 1070 | Fischione 기기 | TEM 그리드의 플라즈마 청소를 위해 | |
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| NuPAGE 4-12% Bis-Tris 단백질 겔 | ThermoFisher Scientific | NP0323BOX | |
| 인산염 완충 식염수, 칼슘 및 마그네슘 미포함 1X | Corning | 21-040-CV | |
| Pierce BCA 단백질 분석 키트 | ThermoFisher Scientific | 23225 | |
| PowerPac 기본 전원 공급 장치 | BioRad | 1645050 | |
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| Silver Stain Plus Kit | BioRad | 1610449 | 이 절차에 사용된 사내 프로토콜이지만 이 키트는 |
| Uranyl Acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 |
참고문헌
- Gill, S., Catchpole, R., Forterre, P. Extracellular membrane vesicles in the three domains of life and beyond. FEMS Microbiology Reviews. 43 (3), 273-303 (2019).
- World Health Organization. GLOBAL TUBERCULOSIS REPORT 2021. World Health Organization. , (2021).
- Prados-R....
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