Microfluidics er et kraftfuldt værktøj til udvikling af diagnostiske tests. Imidlertid kræves ofte dyrt udstyr og materialer samt besværlige fabrikations- og håndteringsteknikker. Her beskriver vi fremstillingsprotokollen for en akrylmikrofluidisk enhed til magnetiske mikro- og nanopartikelbaserede immunoassays i en billig og brugervenlig indstilling.
Mikrofluidiske systemer har stærkt forbedrede immunassayteknikker. Imidlertid kræver mange mikrofabrikationsteknikker specialiseret, dyrt eller kompliceret udstyr, hvilket gør fabrikation dyr og uforenelig med masseproduktion, hvilket er en af de vigtigste forudsætninger for, at point-of-care-tests (POCT) kan vedtages i miljøer med lav ressource. Dette arbejde beskriver fremstillingsprocessen for en akryl (polymethylmethacrylat, PMMA) enhed til nanopartikelkonjugeret enzymatisk immunoassay test ved hjælp af computer numerisk kontrol (CNC) mikromilling teknik. Funktionen af den mikrofluidiske enhed er vist ved at udføre et immunoassay for at detektere et kommercielt antistof ved anvendelse af lysozym som et modelantigen konjugeret til 100 nm magnetiske nanopartikler. Denne enhed integrerer en fysisk forskudt begrænsning på kun 5 μm i højden, der bruges til at fange magnetiske mikropartikler, der udgør en magnetisk fælde ved at placere en ekstern magnet. På denne måde er den magnetiske kraft på immunstøtten af konjugerede nanopartikler nok til at fange dem og modstå strømningstræk. Denne mikrofluidiske enhed er særligt velegnet til billig masseproduktion uden tab af præcision til immunassayydelse.
I de senere år har mikrofluidik spillet en vigtig rolle i immunassayteknikker1. Miniaturiseringsteknologi har mange fremragende fordele sammenlignet med traditionelle immunassays, såsom reduceret prøve- og reagensforbrug, kortere inkubationstider, effektiv løsningsudveksling og højere integration og automatisering2.
Desuden reducerer mikrofluidiske systemer i immunassays i forbindelse med magnetiske nanopartikler som immunstøtte inkubationstiderne betydeligt og opnår høj detektionsfølsomhed på grund af det øgede overflade-til-volumen-forhold3. Brownsk bevægelse af partiklerne forbedrer reaktionskinetikken under dannelsen af antigen-antistofkomplekset 4,5. Desuden giver nanopartiklernes magnetiske egenskaber alsidigheden, der skal integreres i forskellige mikrofluidiske enhedskonfigurationer, hvilket gør dem til en ideel kandidat til signalering og molekylefangst i miniaturiserede on-chip biosensingsystemer5. Magnetiske kræfter er dog betydeligt svagere end trækkræfter på nanometerskalaen på grund af det høje forhold mellem overflade og volumen6. Derfor kan det være udfordrende at fange nanopartikler til vigtige immunassaytrin såsom vask og detektion, og en konventionel magnet er utilstrækkelig4.
En effektiv måde at manipulere nanopartiklerne på er brugen af en mikrofluidisk magnetisk fælde dannet af jernmikropartikler, som er pakket i en mikrofluidisk struktur3. Derfor, når en ekstern magnet nærmer sig, skabes en kompleks interaktion inden for det magnetiserede porøse medium mellem magnetiske og fluxkræfter. Den magnetiske kraft, der virker på nanopartiklerne, er stærk nok til at fange dem og modstå strømningstræk 3,4,7. Denne tilgang kræver mikrofabrikationsteknikker, der opnår opløsninger i størrelsesordenen et par mikrometer for at generere mikrometriske strukturer, der bevarer mikropartiklerne.
Nuværende mikrofabrikationsteknikker tillader fremstilling af strukturer i høj opløsning fra et par mikron til hundreder af nanometer8. Imidlertid kræver mange af disse teknikker specialiseret, dyrt eller kompliceret udstyr. En af de største vanskeligheder er kravet om et renrum til fremstilling af skimmelsvamp, som fortsat er dyrt og tidskrævende 8,9. For nylig har mikrofluidiske ingeniører overvundet denne ulempe ved at udvikle en række alternative fremstillingsmetoder med forskellige fordele såsom reducerede omkostninger, hurtigere behandlingstider, billigere materialer og værktøjer og øget funktionalitet8. På denne måde bragte udviklingen af nye mikrofabrikationsteknikker billige, ikke-renrumsmetoder, der opnår opløsninger så lave som 10 μm8. Mønster kan bruges direkte på et substrat uden at generere et dyrt støbemønster og dermed undgå en tidskrævende proces. Direkte fabrikationsmetoder omfatter CNC-fræsning, laserablation og direkte litografi8. Alle disse metoder er egnede til fremstilling af kanaler med højt aspektforhold i en bred vifte af materialer, uanset deres hårdhed9, hvilket muliggør nye og fordelagtige geometrier, fysisk adfærd og kvaliteter i mikrofluidiske enheder8.
CNC-mikrofræsning skaber mikroskalastrukturer ved hjælp af skæreværktøjer, der fjerner bulkmateriale fra et substrat og er en effektiv fremstillingsmetode til mikrofluidiske enheder10,11. Mikrofræseteknikken kan være nyttig i mikrofluidiske applikationer til at skabe mikrokanaler og funktioner direkte på arbejdsfladen, hvilket giver en vigtig fordel: et emne kan fremstilles på kort tid (mindre end 30 min.), hvilket reducerer behandlingstiden betydeligt fra design til prototype12. Derudover gør den brede tilgængelighed af skæretilbehør af forskellige materialer, størrelser og former CNC-fræsemaskiner til et passende værktøj, der har gjort det muligt at fremstille forskellige funktioner i mange typer billige engangsmaterialer13.
Blandt alle de materialer, der almindeligvis anvendes til mikrofræsning, forbliver termoplast et førende valg på grund af deres mange gunstige egenskaber og kompatibilitet med biologiske anvendelser10,14. Termoplast er et attraktivt substrat for mikrofluidiske systemer på grund af deres betydelige fordele ved udvikling af billige engangsanalysesystemer9. Derudover er disse materialer meget modtagelige for fremstillingsprocesser med høj volumen, hvilket gør dem velegnede til kommercialisering og masseproduktion. Af disse grunde er termoplast som PMMA blevet betragtet som pålidelige og robuste materialer siden de tidlige år af mikrofluidik10. Forskellige protokoller er blevet beskrevet for at fremstille lukkede kanaler i termoplast, såsom opløsningsmiddelbinding15, varmebinding 16 og ultraviolet (UV) / ozonoverfladebehandlingsbinding17.
I mange tilfælde er den positioneringsopløsning, der opnås med konventionelle mikrofræsemaskiner, ikke tilstrækkelig til nogle mikrofluidiske applikationer, der kræver strukturer mindre end 10 μm. High-end mikrofræsning har tilstrækkelig opløsning. På grund af høje priser er brugen desværre begrænset til en håndfuld brugere12. Tidligere rapporterede vores forskningsgruppe fabrikation og manipulation af et billigt værktøj, der muliggør bearbejdning af strukturer på mindre end 10 μm, hvilket overvinder opløsningen af konventionelle fræsemaskiner12. Armaturet er en platform fremstillet ved 3D-print med simpel elektronik, der indeholder tre piezoelektriske aktuatorer. Overfladen indeholder hængselformede samlinger, der gør det muligt at løfte det, når de piezoelektriske elementer virker samtidigt. Z-aksens forskydning kan styres med en opløsning på 500 nm og en nøjagtighed på ±1,5 μm12.
Dette papir præsenterer trinene i fremstillingsprocessen for en akrylanordning (PMMA) gennem en mikrofræsningsteknik. Chipdesignet består af en hovedkanal 200 μm bred og 200 μm høj og en sidekanal med samme dimensioner for at rense strømmen af reagenserne. I den centrale region afbrydes kanalen af en fysisk begrænsning på kun 5 μm i højden, fremstillet med den 3D-printede piezoelektriske platform fremstillet af denne gruppe12, for at fange magnetiske mikropartikler, der udgør en magnetisk fælde for nanopartikler ved at placere en ekstern magnet. Vi viser driften af den mikrofluidiske enhed ved at udføre et immunoassay for at detektere et kommercielt antistof ved hjælp af lysozym som et modelantigen konjugeret til 100 nm magnetiske nanopartikler. Denne enhed kombinerer forskellige funktioner, der gør den unik4: brugen af magnetiske nanopartikler som immunstøtte reducerer den samlede testtid fra timer til minutter; anvendelse af et fluorogent enzym til påvisning giver mulighed for detektionsgrænser, der kan sammenlignes med dem, der gælder for standardenzymbundne immunosorbentassays (ELISA’er); og brugen af en termoplast som fabrikationsmateriale gør den kompatibel med masseproduktion, hvilket ikke var tilfældet for tidligere mikrofluidiske nanopartiklers magnetiske fælder3, og gør det til en fremragende kandidat til at udvikle POCT.
En akrylmikrofluidisk enhed til immunassays ved anvendelse af nanopartikler som immunstøtte blev fremstillet ved hjælp af en mikrofræsningsteknik. Metoden til direkte fremstilling på underlaget har den fordel, at man undgår brugen af en masterform og den tid og de omkostninger, dette indebærer. Det er dog begrænset til hurtig prototyping og fremstilling af enheder med høj volumen.
Her brugte vi en tidligere rapporteret tilbehørsplatform til fræsemaskinen12. Pl…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af Conacyt, Mexico under tilskud 312231 af “Programa de Apoyos para Actividades Científicas, Tecnológicas y de Innovación” og af AMEXCID og det mexicanske udenrigsministerium (SRE) under tilskud “Prueba serológica rápida, barata y de alta sensibilidad para SARS-CoV-2”. JAHO takker Conacyt Mexico for deres ph.d.-stipendium.
0.008 Endmill | KYOCERA SGS | 2204 | 2FL 0.008×1/8×0.12×1-1/12 |
0.032 Endmill | KYOCERA SGS | 2228 | 2FL 0.032×1/8×0.48×1-1/12 |
Carbonyl-iron microparticles | Sigma-Aldrich | 44890 | 7 μm |
Chloroform | Fermont | 6201 | Health Hazard: Moderate Flammability: None Reactivity: None Contact Hazard: Moderate |
CMOS camera Moment | Teledyne Photometrics | Sensor Technology: CMOS Quantum Efficiency: 73% Pixel Size: 4.5 µm x 4.5 µm Supported Interfaces: USB 3.2 Gen 2 |
|
Dr Engrave Software | Roland DGA Corporation | Engraving software to design and create the engraving path on the surface | |
Extraction hood | Unknown | Unknown | |
Flexible Plastic Tubing | Tygon | AAD04103 | ID = 0.020, OD = 0.060 |
Fluorescence microsope | ZEISS | Axio Vert.A1 | |
High Precision Dispense Needle | Loctite | 98612 | |
Homemade piezoelectric controller application | LabView | See reference 12 for more details. | |
Loctite 495 instant adhesive | Henkel | 49503 | Apply with micropipette tip or dispensing needle |
MagJET Separation Rack | thermoscientific | 12 x 1.5 mL | |
Mechanic press | Home-made | ||
Milling Machine | Roland | MDX-50 | |
Piezoelectric platform | Home-made | See reference 12 | |
Polymethylmethacrylate – Sheet – PMMA, Acrylic | Goodfellow | ME303018/1 | Thickness: 1.3 mm, Transparency: Clear/Transparent |
PVCamTest software | Teledyne Photometrics | Version 3.10.107 | Image acquisition software |
Stereo microscope | Nikon | SMZ 7457 | |
SuperMag Carboxyl Beads | Ocean NanoTech | KSC0100 | 100 nm |
Syringe pump | kd Scientific | KDS200 | Can hold up to two syringes |
Utrasonic bath | Branson | 2800 | |
VPanel software | Windows OS | Version 1.0.3.0 | Software for controlling the micromilling machine |