通过电容式免疫探 针在猪 心中对神经肽动力学进行时间分辨体内测量
Summary
已建立的免疫化学方法 在体内 测量肽递质，依靠微透析或体液抽取来获得样品进行离线分析。但是，这些都受到时空限制。本方案描述了克服现有技术局限性的电容式免疫探针生物传感器的制造和应用。
Abstract
在 体内 测量与疾病进展评估相关的生物标志物的能力是科学界和医学界非常感兴趣的。从当前测量某些生物标志物的方法获得的结果的分辨率可能需要几天或几周才能获得，因为它们在空间和时间上的分辨率都受到限制（例如，通过酶联免疫吸附测定[ELISA]，高效液相色谱[HPLC]或质谱分析的间质液的流体室微透析）;因此，他们对及时诊断和治疗的指导被打乱了。在本研究中，报道了通过使用电容式免疫探针生物传感器（CI探针） 在体内 检测和测量肽递质的独特技术。描述了这些探针的制造方案和 体外 表征。提供交感神经刺激诱导的神经肽Y（NPY） 在体内 释放的测量。NPY释放与去甲肾上腺素的交感神经释放相关，以供参考。数据证明了一种 在体内快速和局部测量神经肽的方法。未来的应用包括术中实时评估疾病进展和基于微创导管的这些探针部署。
Introduction
用于检测和定量生物标志物的几种化学方法通常用于蛋白质化学和临床诊断，特别是在癌症诊断和心血管疾病进展评估中。目前，诸如高效液相色谱（HPLC）、酶联免疫吸附测定（ELISA）和质谱等方法依赖于通过本体流体抽取从血管区1，2，3 或通过微透析从血管区室收集样品。微透析采用已知长度的半透膜管，放置在感兴趣的区域。收集液通过管注水4 分钟以收集样品进行分析5，从而限制了时间分辨率。以这种方式，收集的样品仅提供局部微环境随时间变化的平均值，并且受到灌注速率和收集足够样品体积的限制。此外，这些方法需要汇集实验数据和信号平均;因此，他们可能无法解释受试者之间的可变性。重要的是，样本收集和随后的离线分析之间的时间排除了即时临床干预和治疗。
在本方案中，概述了使用电容式免疫探针生物传感器（CI探针）对特定生物活性肽进行时间分辨电检测。神经肽Y（NPY）从神经节后交感神经元释放，支配脉管系统，心内膜，心肌细胞和心内神经节，是心血管系统中主要的神经调节肽递质6，7，8，9。本文提出的方法旨在测量NPY，并在猪心模型中证明了实验可行性。然而，这种方法适用于任何生物活性肽，其选择性抗体是可用的10。该方法依赖于铂丝探头与功能化尖端11，12处的导电流体之间的电容结。在该应用中，相互作用通过针对靶神经肽（NPY）的抗体介导，该抗体与电极尖端结合，与导电流体环境连接。这种功能化是通过反应性聚多巴胺电沉积到铂丝探针10，13的尖端来实现的。
当抗体功能化探针放置在体内感兴趣的区域 时，诱发的内源性NPY释放导致与探针尖端上的捕获抗体结合，并且电极表面的导电液被NPY蛋白置换。电气环境中的局部变化导致具有高迁移率，高介电流体的位移，具有不动的带静电的分子。这改变了电极 – 流体界面，从而改变了其电容，其被测量为响应阶跃函数命令电位的电荷电流的变化。在每个单独的测量周期之后立即采用负的“复位”电位，通过静电相互作用排斥抗体中结合的NPY，从而清除抗体结合位点以进行后续的测量10。这有效地允许以时间分辨的方式测量NPY。独特的CI技术克服了上述基于微透析的免疫化学方法的局限性，从单个实验中测量动态生物标志物水平，而无需在多个实验上进行数据池或信号平均9，提供近乎实时的数据。此外，将这种方法适应任何感兴趣的生物标志物的能力，在时间分辨和局部尺度上存在适当的抗体，为评估疾病进展和指导治疗干预提供了免疫化学测量的重大技术进步。
用于数据采集和分析的软件是用IGOR Pro（一个完全交互式的软件环境）定制的。模数转换器（A/D）系统在计算机控制下发出命令电压，并从定制放大器获取数据。该放大器具有某些独特的功能。这些器件包括一个反馈电阻（可切换），用于四个采集通道中的每一个，允许选择1 MOhm或10 MOhm反馈电压钳位电路来集成电极的可变性。还构建了一个具有单个磁头和所有四个采集通道的相互接地/参考电路的载物台单元，以将设备放置在单个物理模块中靠近胸部的位置。使用1 MOhm反馈电阻设置来收集所有报告的数据。
滤波器和增益设置由放大器电报，并记录在数据文件中。数据通过10 kHz数字化的2极点模拟贝塞尔滤波器以1 kHz进行滤波。探头和周围导电溶液之间的电位差在探头尖端形成亥姆霍兹电容层。配体与探针尖端的抗体结合导致局部电荷改变，从而导致亥姆霍兹电容的变化。电路容性分量的这种变化导致将探头带到阶跃函数电压协议中的电位所需的注入电荷大小发生变化。因此，特定配体与功能化探头的结合导致电极电容测量的变化，作为峰值电容电流的变化。
Protocol
Representative Results
Discussion
本方案描述了能够在 体外 和体内环境中检测和测量感兴趣的生物标志物的电容式免疫探针（CI探针）的制造和 测试 。通过将生物标志物捕获在电极尖端来实现检测。捕获事件改变了铂丝电容式免疫探针与周围导电流体环境之间的电容结，测量为响应探头中电位移位的电荷电流变化。还提出了一种独特的电采集方案，该方案允许通过静电排斥探针尖端上捕获的生物标志物，在检测周?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢 Olu Ajijola 博士（加州大学洛杉矶分校心律失常中心）对 体内 实验的专家支持。这项工作得到了NIH U01 EB025138（JLA，CS）的支持。
Materials
| AgCl disc electrode | Warner Instruments (Holliston, MA) | 64-1307 | |
| Anti-NPY monoclonal antibody | Abcam, (Cambridge, MA) | ab112473 | |
| Custom multichannel amplifier/ 1 MΩ feedback resistor multichannel headstage | NPI Electronic, (Tamm, Germany) | NA | Based on NPI VA-10M multichannel amplifier |
| Dopamine HCl | Sigma Aldrich (St. Louis, MO) | H8502-10G | |
| Gold-plated male connector pin | AMP-TE Connectivity (Amplimite) | 6-66506-1 | |
| HEKA LIH 8+8 analog-to-digital/digital-to-analog device | HEKA Elektronik, (Holliston, MA) | NA | |
| Igor Pro data acquisition software, v. 7.08 | WaveMetrics, (Lake Oswego, OR) | Software driving command potential and data acquisition was custom written | |
| Masterflex L/S Standard Digital peristaltic pump | Cole Palmer, (Vernon Hills, IL) | ||
| PFA-coated platinum wire | A-M Systems, (Sequim, WA) | 773000 | 0.005” bare diameter, 0.008” coated diameter |
| Silicone elastomer | World Precision Instruments (Sarasota, FL) | SYLG184 | |
| Synthetic porcine NPY peptide | Bachem (Torrance, CA) | 4011654 | |
| Synthetic porcine NPY peptide | Bachem (Torrance, CA) | 4011654 |
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