पोर्सिन हार्ट में कैपेसिटिव इम्यूनोप्रोब द्वारा न्यूरोपेप्टाइड डायनेमिक्स के विवो मापन में समय-समाधान
Summary
विवो में पेप्टाइड ट्रांसमीटरों को मापने के लिए स्थापित इम्यूनोकेमिकल तरीके ऑफ़लाइन विश्लेषण के लिए नमूना प्राप्त करने के लिए माइक्रोडायलिसिस या थोक द्रव ड्रॉ पर भरोसा करते हैं। हालांकि, ये स्थानिक सीमाओं से पीड़ित हैं। वर्तमान प्रोटोकॉल एक कैपेसिटिव इम्यूनोप्रोब बायोसेंसर के निर्माण और अनुप्रयोग का वर्णन करता है जो मौजूदा तकनीकों की सीमाओं को दूर करता है।
Abstract
रोग प्रगति के आकलन के लिए प्रासंगिक विवो में बायोमार्कर को मापने की क्षमता वैज्ञानिक और चिकित्सा समुदायों के लिए बहुत रुचि रखती है। कुछ बायोमार्करों को मापने के वर्तमान तरीकों से प्राप्त परिणामों के संकल्प को प्राप्त करने में कई दिन या सप्ताह लग सकते हैं, क्योंकि उन्हें स्थानिक और अस्थायी रूप से दोनों रिज़ॉल्यूशन में सीमित किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, एंजाइम-लिंक्ड इम्यूनोसॉर्बेंट परख [एलिसा], उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी [एचपीएलसी], या मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा विश्लेषण किए गए अंतरालीय तरल पदार्थ के द्रव डिब्बे माइक्रोडायलिसिस); इस प्रकार, समय पर निदान और उपचार का उनका मार्गदर्शन बाधित होता है। वर्तमान अध्ययन में, कैपेसिटिव इम्यूनोप्रोब बायोसेंसर (सीआई जांच) के उपयोग के माध्यम से विवो में पेप्टाइड ट्रांसमीटरों का पता लगाने और मापने के लिए एक अनूठी तकनीक की सूचना दी गई है। निर्माण प्रोटोकॉल और इन जांच के कृत्रिम परिवेशीय लक्षण वर्णन में वर्णित हैं। विवो में सहानुभूति उत्तेजना-विकसित न्यूरोपेप्टाइड वाई (एनपीवाई) रिलीज के माप प्रदान किए जाते हैं। एनपीवाई रिलीज संदर्भ के लिए नॉरपेनेफ्रिन की सहानुभूतिपूर्ण रिहाई से संबंधित है। डेटा विवो में न्यूरोपेप्टाइड्स के तेज और स्थानीयकृत माप के लिए एक दृष्टिकोण प्रदर्शित करता है। भविष्य के अनुप्रयोगों में रोग की प्रगति का इंट्राऑपरेटिव वास्तविक समय मूल्यांकन और इन जांचों की न्यूनतम इनवेसिव कैथेटर-आधारित तैनाती शामिल है।
Introduction
बायोमार्कर का पता लगाने और मात्रा निर्धारित करने के लिए कई रासायनिक तरीकों का नियमित रूप से प्रोटीन रसायन विज्ञान और नैदानिक निदान दोनों में उपयोग किया जाता है, विशेष रूप से कैंसर के निदान और हृदय रोग प्रगति के मूल्यांकन में। वर्तमान में, उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (एचपीएलसी), एंजाइम-लिंक्ड इम्यूनोसॉर्बेंट परख (एलिसा), और मास स्पेक्ट्रोमेट्री जैसे तरीके संवहनी डिब्बे 1,2,3 से थोक द्रव ड्रा या माइक्रोडायलिसिस द्वारा अंतरालीय डिब्बे से नमूना संग्रह पर भरोसा करते हैं। माइक्रोडायलिसिस ज्ञात लंबाई की एक अर्धपारगम्य झिल्ली ट्यूब को नियोजित करता है जिसे ब्याज के क्षेत्र में रखा जाता है। संग्रह तरल पदार्थ विश्लेषण 5 के लिए नमूना इकट्ठा करने के लिए कई मिनट4 पर ट्यूब के माध्यम से सुगंधितकिया जाता है, इस प्रकार अस्थायी संकल्प को सीमित करता है। इस तरह, एकत्र किए गए नमूने केवल स्थानीय माइक्रोएन्वायरमेंट के समय के साथ एक औसत मूल्य प्रदान करते हैं और छिड़काव दर और पर्याप्त नमूना मात्रा के संग्रह द्वारा सीमित होते हैं। इसके अलावा, इन विधियों को प्रयोगात्मक डेटा और सिग्नल औसत के पूलिंग की आवश्यकता होती है; इसलिए, वे विषयों के बीच परिवर्तनशीलता के लिए खाते में विफल हो सकते हैं। महत्वपूर्ण बात यह है कि नमूना संग्रह और बाद के ऑफ़लाइन विश्लेषण के बीच का समय तत्काल नैदानिक हस्तक्षेप और चिकित्सीय को रोकता है।
वर्तमान प्रोटोकॉल में, विशिष्ट बायोएक्टिव पेप्टाइड्स के समय-हल विद्युत का पता लगाने के लिए कैपेसिटिव इम्यूनोप्रोब बायोसेंसर (सीआई जांच) के उपयोग को रेखांकित किया गया है। न्यूरोपेप्टाइड वाई (एनपीवाई), पोस्ट-गैंग्लियोनिक सहानुभूति न्यूरॉन्स से जारी किया जाता है जो वास्कुलचर, एंडोकार्डियम, कार्डियोमायोसाइट्स और इंट्राकार्डियक गैन्ग्लिया को आंतरिक बनाता है, कार्डियोवैस्कुलर सिस्टम 6,7,8,9 में एक प्रमुख न्यूरोमॉड्यूलेटरी पेप्टाइड ट्रांसमीटर है। यहां प्रस्तुत विधि को एनपीवाई को मापने के लिए डिज़ाइन किया गया है, और प्रायोगिक व्यवहार्यता को पोर्सिन हृदय मॉडल में प्रदर्शित किया गया है। हालांकि, यह दृष्टिकोण किसी भी बायोएक्टिव पेप्टाइड पर लागू होता है जिसके लिए एक चयनात्मक एंटीबॉडी उपलब्ध है10. यह विधि कार्यात्मक टिप11,12 पर प्लैटिनम तार जांच और प्रवाहकीय तरल पदार्थ के बीच कैपेसिटिव जंक्शन पर निर्भर करती है। इस एप्लिकेशन में, इंटरैक्शन को लक्ष्य न्यूरोपेप्टाइड (एनपीवाई) के खिलाफ एंटीबॉडी के माध्यम से मध्यस्थता की गई थी, जो इलेक्ट्रोड टिप से बंधा हुआ था, प्रवाहकीय द्रव वातावरण को इंटरफेस करता था। यह कार्यात्मकता प्लैटिनम तार जांच10,13 की नोक पर प्रतिक्रियाशील पॉलीडोपामाइन के इलेक्ट्रोडिपोजिशन के माध्यम से प्राप्त की गई थी।
जब एंटीबॉडी-कार्यात्मक जांच को विवो में रुचि के क्षेत्र में रखा जाता है, तो अंतर्जात एनपीवाई रिलीज जांच टिप पर फंसाने वाले एंटीबॉडी के लिए बाध्यकारी होता है, और इलेक्ट्रोड सतह पर प्रवाहकीय तरल पदार्थ एनपीवाई प्रोटीन द्वारा विस्थापित होता है। विद्युत वातावरण में स्थानीय परिवर्तन के परिणामस्वरूप एक स्थिर, स्थिर रूप से चार्ज अणु के साथ उच्च गतिशीलता, उच्च ढांकता हुआ तरल पदार्थ का विस्थापन होता है। यह इलेक्ट्रोड-द्रव इंटरफ़ेस को बदल देता है और इस प्रकार, इसकी समाई, जिसे चरण-फ़ंक्शन कमांड क्षमता के जवाब में चार्ज वर्तमान में परिवर्तन के रूप में मापा जाता है। इलेक्ट्रोस्टैटिक इंटरैक्शन के माध्यम से एंटीबॉडी से बाध्य एनपीवाई को पीछे हटाने के लिए प्रत्येक व्यक्तिगत माप चक्र के तुरंत बाद एक नकारात्मक “रीसेट” क्षमता नियोजित की जाती है, इस प्रकार माप10 के बाद के दौर के लिए एंटीबॉडी बाध्यकारी साइटों को साफ़ किया जाता है। यह प्रभावी रूप से समय-समाधान तरीके से एनपीवाई के माप की अनुमति देता है। अद्वितीय सीआई तकनीक डेटा पूलिंग या सिग्नल औसत के बिना एक ही प्रयोग से गतिशील बायोमार्कर स्तरों को मापने के लिए ऊपर उल्लिखित माइक्रोडायलिसिस-आधारित इम्यूनोकेमिकल विधियों की सीमाओं को पार करती है, जो लगभग वास्तविक समय में डेटा प्रदान करती है। इसके अलावा, इस पद्धति को ब्याज के किसी भी बायोमार्कर के अनुकूल बनाने की क्षमता जिसके लिए समय-समाधान और स्थानीयकृत पैमाने पर एक उपयुक्त एंटीबॉडी मौजूद है, रोग प्रगति के मूल्यांकन और चिकित्सीय हस्तक्षेपों के मार्गदर्शन के लिए इम्यूनोकेमिकल माप में एक प्रमुख तकनीकी अग्रिम प्रदान करता है।
डेटा अधिग्रहण और विश्लेषण के लिए सॉफ्टवेयर आईजीओआर प्रो (एक पूरी तरह से इंटरैक्टिव सॉफ्टवेयर वातावरण) में कस्टम-लिखित था। डिजिटल कनवर्टर (ए /डी) सिस्टम के लिए एक एनालॉग कंप्यूटर नियंत्रण के तहत एक कमांड वोल्टेज जारी करता है और एक कस्टम एम्पलीफायर से डेटा प्राप्त करता है। एम्पलीफायर में कुछ अनूठी विशेषताएं थीं। इनमें चार अधिग्रहण चैनलों में से प्रत्येक के लिए एक प्रतिक्रिया रोकनेवाला (स्विचेबल) शामिल था, जिससे इलेक्ट्रोड की परिवर्तनशीलता को एकीकृत करने के लिए 1 एमओएचएम या 10 एमओएचएम फीडबैक वोल्टेज क्लैंप सर्किट चुनने की अनुमति मिलती है। सभी चार अधिग्रहण चैनलों के लिए एक एकल सिर और पारस्परिक जमीन / संदर्भ सर्किट के साथ एक चरण इकाई भी एक भौतिक मॉड्यूल में छाती के करीब डिवाइस को रखने के लिए बनाई गई थी। सभी रिपोर्ट किए गए डेटा को इकट्ठा करने के लिए एक 1 एमओएचएम फीडबैक रोकनेवाला सेटिंग का उपयोग किया गया था।
फ़िल्टर और लाभ सेटिंग्स को एम्पलीफायर से टेलीग्राफ किया गया था और डेटा फ़ाइल के भीतर दर्ज किया गया था। डेटा को 10 किलोहर्ट्ज़ पर डिजिटाइज्ड 2-पोल एनालॉग बेसेल फ़िल्टर के माध्यम से 1 किलोहर्ट्ज़ पर फ़िल्टर किया गया था। जांच और आसपास के प्रवाहकीय समाधान के बीच क्षमता में अंतर जांच टिप पर एक हेल्महोल्ट्ज कैपेसिटिव परत बनाता है। जांच टिप पर एंटीबॉडी के लिए लिगैंड बाइंडिंग के परिणामस्वरूप एक परिवर्तित स्थानीय चार्ज होता है और इस प्रकार, हेल्महोल्ट्ज समाई में बदलाव होता है। सर्किट के कैपेसिटिव घटक में इस परिवर्तन के परिणामस्वरूप चरण-फ़ंक्शन वोल्टेज प्रोटोकॉल में जांच को क्षमता में लाने के लिए आवश्यक इंजेक्शन चार्ज के परिमाण में बदलाव होता है। इस प्रकार, कार्यात्मक जांच के लिए एक विशिष्ट लिगैंड के बंधन के परिणामस्वरूप इलेक्ट्रोड समाई माप में शिखर कैपेसिटिव वर्तमान में परिवर्तन होता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
वर्तमान प्रोटोकॉल इन विट्रो और विवो सेटिंग्स दोनों में रुचि के बायोमार्कर का पता लगाने और मापने में सक्षम एक कैपेसिटिव इम्यूनोप्रोब (सीआई जांच) के निर्माण और परीक्षण का वर्णन करता है। इलेक्ट्र…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम इन विवो प्रयोगों के लिए विशेषज्ञ समर्थन के लिए डॉ ओलू अजिजोला (यूसीएलए कार्डियक अतालता केंद्र) को धन्यवाद देते हैं। इस काम को एनआईएच यू 01 ईबी 025138 (जेएलए, सीएस) द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| AgCl disc electrode | Warner Instruments (Holliston, MA) | 64-1307 | |
| Anti-NPY monoclonal antibody | Abcam, (Cambridge, MA) | ab112473 | |
| Custom multichannel amplifier/ 1 MΩ feedback resistor multichannel headstage | NPI Electronic, (Tamm, Germany) | NA | Based on NPI VA-10M multichannel amplifier |
| Dopamine HCl | Sigma Aldrich (St. Louis, MO) | H8502-10G | |
| Gold-plated male connector pin | AMP-TE Connectivity (Amplimite) | 6-66506-1 | |
| HEKA LIH 8+8 analog-to-digital/digital-to-analog device | HEKA Elektronik, (Holliston, MA) | NA | |
| Igor Pro data acquisition software, v. 7.08 | WaveMetrics, (Lake Oswego, OR) | Software driving command potential and data acquisition was custom written | |
| Masterflex L/S Standard Digital peristaltic pump | Cole Palmer, (Vernon Hills, IL) | ||
| PFA-coated platinum wire | A-M Systems, (Sequim, WA) | 773000 | 0.005” bare diameter, 0.008” coated diameter |
| Silicone elastomer | World Precision Instruments (Sarasota, FL) | SYLG184 | |
| Synthetic porcine NPY peptide | Bachem (Torrance, CA) | 4011654 | |
| Synthetic porcine NPY peptide | Bachem (Torrance, CA) | 4011654 |
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