الوقت الذي تم حله في الجسم الحي قياس ديناميكيات Neuropeptide بواسطة مسبار مناعي سعوي في قلب لحم الخنزير
Summary
تعتمد الطرق الكيميائية المناعية المعمول بها لقياس أجهزة إرسال الببتيد في الجسم الحي على غسيل الكلى المجهري أو سحب السوائل السائبة للحصول على العينة لتحليلها في وضع عدم الاتصال. ومع ذلك ، فإن هذه تعاني من قيود مكانية زمنية. يصف هذا البروتوكول تصنيع وتطبيق جهاز استشعار حيوي مناعي سعوي يتغلب على قيود التقنيات الحالية.
Abstract
إن القدرة على قياس المؤشرات الحيوية في الجسم الحي ذات الصلة بتقييم تطور المرض ذات أهمية كبيرة للأوساط العلمية والطبية. ويمكن أن يستغرق الحصول على استبانة النتائج التي يتم الحصول عليها من الطرق الحالية لقياس بعض المؤشرات الحيوية عدة أيام أو أسابيع، حيث يمكن أن تكون محدودة في الدقة مكانيا وزمنيا (على سبيل المثال، الغسيل المجهري لحجرة السوائل للسائل الخلالي الذي يتم تحليله بواسطة مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم [ELISA]، أو الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء [HPLC]، أو قياس الطيف الكتلي)؛ وبالتالي ، فإن توجيههم للتشخيص والعلاج في الوقت المناسب يتعطل. في هذه الدراسة ، تم الإبلاغ عن تقنية فريدة للكشف عن أجهزة إرسال الببتيد وقياسها في الجسم الحي من خلال استخدام مستشعر حيوي مناعي سعوي (مسبار CI). يتم وصف بروتوكول التصنيع والتوصيف في المختبر لهذه المجسات. يتم توفير قياسات لإطلاق neuropeptide Y (NPY) المستحضر للتحفيز الودي في الجسم الحي . يرتبط إصدار NPY بالإصدار الودي للنورادرينالين كمرجع. توضح البيانات نهجا للقياس السريع والموضعي للببتيدات العصبية في الجسم الحي. وتشمل التطبيقات المستقبلية التقييم في الوقت الحقيقي أثناء العملية الجراحية لتطور المرض والنشر القائم على القسطرة طفيفة التوغل لهذه المجسات.
Introduction
تستخدم العديد من الطرق الكيميائية للكشف عن المؤشرات الحيوية وقياسها بشكل روتيني في كل من كيمياء البروتين والتشخيص السريري ، خاصة في تشخيص السرطان وتقييم تطور أمراض القلب والأوعية الدموية. حاليا، تعتمد طرق مثل الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء (HPLC)، ومقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA)، وقياس الطيف الكتلي على جمع العينات من حجرة الأوعية الدموية1،2،3 عن طريق سحب السوائل السائبة أو المقصورة الخلالية عن طريق غسيل الكلى المجهري. يستخدم غسيل الكلى المجهري أنبوب غشاء شبه نافذ بطول معروف يتم وضعه في منطقة ذات أهمية. يتم تمرير سائل التجميع عبر الأنبوب على مدى عدة دقائق4 لجمع العينة للتحليل5 ، مما يحد من الدقة الزمنية. وبهذه الطريقة، لا توفر العينات المجمعة سوى قيمة متوسطة مع مرور الوقت للبيئة الدقيقة المحلية وتكون محدودة بمعدل التروية وجمع حجم كاف من العينات. وعلاوة على ذلك، تتطلب هذه الأساليب تجميع البيانات التجريبية ومتوسط الإشارات؛ لذلك ، قد يفشلون في حساب التباين بين الموضوعات. الأهم من ذلك ، أن الوقت بين جمع العينات والتحليل اللاحق دون اتصال بالإنترنت يمنع التدخل السريري الفوري والعلاجات.
في هذا البروتوكول ، يتم تحديد استخدام مستشعر حيوي مناعي سعوي (CI probe) للكشف الكهربائي الذي يتم حله في الوقت المناسب عن ببتيدات نشطة بيولوجيا محددة. Neuropeptide Y (NPY) ، الذي تم إطلاقه من الخلايا العصبية الودية ما بعد العقدية التي تعصب الأوعية الدموية ، والشغاف ، والخلايا العضلية القلبية ، والعقد داخل القلب ، هو ناقل الببتيد العصبي الرئيسي في نظام القلب والأوعية الدموية6،7،8،9. تم تصميم الطريقة المعروضة هنا لقياس NPY ، ويتم توضيح الجدوى التجريبية في نموذج قلب الخنزير. ومع ذلك ، ينطبق هذا النهج على أي ببتيد نشط بيولوجيا يتوفر له جسم مضاد انتقائي10. تعتمد هذه الطريقة على التقاطع السعوي بين مسبار سلك بلاتيني والسائل الموصل عند الطرف الوظيفي11,12. في هذا التطبيق ، تم التوسط في التفاعل من خلال جسم مضاد ضد neuropeptide المستهدف (NPY) ، والذي كان مرتبطا بطرف القطب الكهربائي ، وربط بيئة السائل الموصل. تم تحقيق هذا الأداء من خلال الترسيب الكهربائي لمادة البوليدوبامين التفاعلية على طرف مسبار الأسلاك البلاتينية10,13.
عندما يتم وضع المسبار الوظيفي للأجسام المضادة في منطقة ذات أهمية في الجسم الحي ، يؤدي إطلاق NPY الداخلي المستحضر إلى الارتباط بالأجسام المضادة المحاصرة على طرف المسبار ، ويتم إزاحة السائل الموصل على سطح القطب الكهربائي بواسطة بروتين NPY. يؤدي التغيير المحلي في البيئة الكهربائية إلى إزاحة سائل عالي الحركة وعازل كهربائي عالي مع جزيء غير متحرك ومشحون بشكل ثابت. هذا يغير واجهة القطب والسائل ، وبالتالي ، سعته ، والتي تقاس كتغيير في تيار الشحنة استجابة لجهد أمر وظيفة الخطوة. يتم استخدام جهد “إعادة ضبط” سلبي مباشرة بعد كل دورة قياس فردية لصد NPY المرتبط من الجسم المضاد من خلال التفاعل الكهروستاتيكي ، وبالتالي تطهير مواقع ربط الأجسام المضادة لجولات القياس اللاحقة10. هذا يسمح بشكل فعال لقياس NPY بطريقة يتم حلها في الوقت المناسب. تتغلب تقنية CI الفريدة من نوعها على قيود الطرق الكيميائية المناعية القائمة على غسيل الكلى المجهري الموضحة أعلاه لقياس مستويات المؤشرات الحيوية الديناميكية من تجربة واحدة دون تجميع البيانات أو الإشارة في المتوسط على مدى العديد من التجارب9 ، مما يوفر البيانات في الوقت الفعلي تقريبا. وعلاوة على ذلك، فإن القدرة على تكييف هذه الطريقة مع أي مؤشر حيوي ذي أهمية يوجد له جسم مضاد مناسب على نطاق زمني محدد ومحدد الموقع يوفر تقدما تقنيا كبيرا في القياس الكيميائي المناعي لتقييم تطور المرض وتوجيه التدخلات العلاجية.
وكان البرنامج الحاسوبي للحصول على البيانات وتحليلها مكتوبا خصيصا في IGOR Pro (بيئة برمجية تفاعلية بالكامل). أصدر نظام محول تناظري إلى رقمي (A / D) جهدا قياديا تحت سيطرة الكمبيوتر وحصل على بيانات من مكبر صوت مخصص. يمتلك مكبر الصوت بعض الميزات الفريدة. وشملت هذه مقاومة التغذية المرتدة (قابلة للتبديل) لكل قناة من قنوات الاستحواذ الأربع ، مما يسمح باختيار 1 MOhm أو 10 دوائر مشبك الجهد التغذية المرتدة MOhm لدمج تباين القطب الكهربائي. كما تم بناء وحدة مرحلة ذات رأس واحد ودائرة أرضية / مرجعية متبادلة لجميع قنوات الاستحواذ الأربع لوضع الجهاز بالقرب من الصدر في وحدة مادية واحدة. تم استخدام إعداد مقاوم التغذية المرتدة 1 MOhm لجمع جميع البيانات المبلغ عنها.
تم تلغراف إعدادات المرشح والكسب من مكبر الصوت وتسجيلها داخل ملف البيانات. تمت تصفية البيانات عند 1 كيلو هرتز عبر مرشح بيسل تناظري ثنائي القطب رقمي عند 10 كيلو هرتز. الفرق في الجهد بين المسبار والحل الموصل المحيط يخلق طبقة سعوية هيلمهولتز عند طرف المسبار. يؤدي ربط الليغاند بالجسم المضاد عند طرف المسبار إلى تغيير الشحنة المحلية ، وبالتالي تغيير في سعة هيلمهولتز. يؤدي هذا التغيير في المكون السعوي للدائرة إلى تحول في حجم الشحنة المحقونة المطلوبة لجلب المسبار إلى الجهد المحتمل في بروتوكول الجهد ذي الوظيفة التدريجية. وبالتالي ، فإن ربط رباط معين بالمسبار الوظيفي يؤدي إلى تغيير في قياس سعة القطب الكهربائي كتغيير في ذروة التيار السعوي.
Protocol
Representative Results
Discussion
يصف هذا البروتوكول تصنيع واختبار مسبار مناعي سعوي (مسبار CI) قادر على اكتشاف وقياس المؤشرات الحيوية ذات الأهمية في كل من المختبر والجسم الحي . يتم تحقيق الكشف عن طريق محاصرة العلامة الحيوية عند طرف القطب الكهربائي. يغير حدث الاصطياد التقاطع السعوي بين مسبار مناعي سعوي من الأسلاك ا…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر الدكتور أولو أجيجولا (مركز عدم انتظام ضربات القلب بجامعة كاليفورنيا في لوس أنجلوس) على دعم الخبراء للتجارب في الجسم الحي . تم دعم هذا العمل من قبل NIH U01 EB025138 (JLA ، CS).
Materials
| AgCl disc electrode | Warner Instruments (Holliston, MA) | 64-1307 | |
| Anti-NPY monoclonal antibody | Abcam, (Cambridge, MA) | ab112473 | |
| Custom multichannel amplifier/ 1 MΩ feedback resistor multichannel headstage | NPI Electronic, (Tamm, Germany) | NA | Based on NPI VA-10M multichannel amplifier |
| Dopamine HCl | Sigma Aldrich (St. Louis, MO) | H8502-10G | |
| Gold-plated male connector pin | AMP-TE Connectivity (Amplimite) | 6-66506-1 | |
| HEKA LIH 8+8 analog-to-digital/digital-to-analog device | HEKA Elektronik, (Holliston, MA) | NA | |
| Igor Pro data acquisition software, v. 7.08 | WaveMetrics, (Lake Oswego, OR) | Software driving command potential and data acquisition was custom written | |
| Masterflex L/S Standard Digital peristaltic pump | Cole Palmer, (Vernon Hills, IL) | ||
| PFA-coated platinum wire | A-M Systems, (Sequim, WA) | 773000 | 0.005” bare diameter, 0.008” coated diameter |
| Silicone elastomer | World Precision Instruments (Sarasota, FL) | SYLG184 | |
| Synthetic porcine NPY peptide | Bachem (Torrance, CA) | 4011654 | |
| Synthetic porcine NPY peptide | Bachem (Torrance, CA) | 4011654 |
References
- Chow, S. L., et al. Role of Biomarkers for the prevention, assessment, and management of heart failure: A scientific statement from the American Heart Association. Circulation. 135 (22), 1054-1091 (2017).
- Goldstein, D. S. Adrenal responses to stress. Cellular and Molecular Neurobiology. 30 (8), 1433-1440 (2010).
- Ullman, B., Hulting, J., Lundberg, J. M. Prognostic value of plasma neuropeptide-Y in coronary care unit patients with and without acute myocardial infarction. European Heart Journal. 15 (4), 454-461 (1994).
- Farrell, D. M., et al. Angiotensin II modulates catecholamine release into interstitial fluid of canine myocardium in vivo. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 281 (2), 813-822 (2001).
- Ardell, J. L., Foreman, R. D., Armour, J. A., Shivkumar, K. Cardiac sympathectomy and spinal cord stimulation attenuate reflex-mediated norepinephrine release during ischemia preventing ventricular fibrillation. JCI Insight. 4 (23), 131648 (2019).
- Franco-Cereceda, A., Lundberg, J. M., Dahlof, C. Neuropeptide Y and sympathetic control of heart contractility and coronary vascular tone. Acta Physiologica Scandinavica. 124 (3), 361-369 (1985).
- Habecker, B. A., et al. Molecular and cellular neurocardiology: development, and cellular and molecular adaptations to heart disease. The Journal of Physiology. 594 (14), 3853-3875 (2016).
- Hoang, J. D., Salavatian, S., Yamaguchi, N., Swid, M. A., Vaseghi, M. Cardiac sympathetic activation circumvents high-dose beta blocker therapy in part through release of neuropeptide Y. JCI Insight. 5 (11), 135519 (2020).
- Rigel, D. F. Effects of neuropeptides on heart rate in dogs: comparison of VIP, PHI, NPY, CGRP, and NT. American Journal of Physiology. 255, 311-317 (1988).
- Kluge, N., et al. Rapid measurement of cardiac neuropeptide dynamics by capacitive immunoprobe in the porcine heart. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 320 (1), 66-76 (2021).
- Berggren, C., Bjarnason, B., Johansson, G. Capacitive biosensors. Electroanalysis. 13 (3), 173-180 (2001).
- Prodromidis, M. I. Impedimetric immunosensors-A review. Electrochimica Acta. 55 (14), 4227-4233 (2010).
- Lee, H., Dellatore, S. M., Miller, W. M., Messersmith, P. B. Mussel-inspired surface chemistry for multifunctional coatings. Science. 318 (5849), 426-430 (2007).
- Leszczyszyn, D. J., et al. Secretion of catecholamines from individual adrenal medullary chromaffin cells. Journal of Neurochemistry. 56 (6), 1855-1863 (1991).
- Pihel, K., Schroeder, T. J., Wightman, R. M. Rapid and selective cyclic voltammetric measurements of epinephrine and norepinephrine as a method to measure secretion from single bovine adrenal medullary cells. Analytical Chemistry. 66 (24), 4532-4537 (1994).
- Jaffe, E. H., Marty, A., Schulte, A., Chow, R. H. Extrasynaptic vesicular transmitter release from the somata of substantia nigra neurons in rat midbrain slices. The Journal of Neuroscience. 18 (10), 3548-3553 (1998).
- Walsh, P. L., Petrovic, J., Wightman, R. M. Distinguishing splanchnic nerve and chromaffin cell stimulation in mouse adrenal slices with fast-scan cyclic voltammetry. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 300 (1), 49-57 (2011).
- Wolfe, J. T., Wang, H., Perez-Reyes, E., Barrett, P. Q. Stimulation of recombinant Ca(v)3.2, T-type, Ca(2+) channel currents by CaMKIIgamma(C). The Journal of Physiology. 538, 343-355 (2002).
- Chan, S. A., et al. Fast in vivo detection of myocardial norepinephrine levels in the beating porcine heart. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 318 (5), 1091-1099 (2020).
- Chow, R. H., von Rüden, L., Sakmann, B., Neher, E. . Single-Channel Recording, Second Edition. , 245-275 (1995).
- Ren, Y., et al. Facile, high efficiency immobilization of lipase enzyme on magnetic iron oxide nanoparticles via a biomimetic coating. BMC Biotechnology. 11, 63 (2011).
