Medição in vivo de neuropeptídeos por imunoprobe capacitivo no coração suíno

Summary

Métodos imunoquímicos estabelecidos para medir transmissores de peptídeos in vivo dependem de microdiálise ou desenho de fluido a granel para obter a amostra para análise offline. No entanto, estes sofrem de limitações espessotemporais. O presente protocolo descreve a fabricação e aplicação de um biosensor de imunoprobe capacitivo que supera as limitações das técnicas existentes.

Abstract

A capacidade de medir biomarcadores in vivo relevantes para a avaliação da progressão da doença é de grande interesse para as comunidades científicas e médicas. A resolução dos resultados obtidos a partir dos métodos atuais de medição de certos biomarcadores pode levar vários dias ou semanas para ser obtida, pois podem ser limitados em resolução tanto espacial quanto temporal (por exemplo, microdiálise com compartimento fluido de fluido interssumatar analisado por ensaio imunossorbente ligado à enzima [ELISA], cromatografia líquida de alto desempenho [HPLC], ou espectrometria de massa); assim, sua orientação de diagnóstico e tratamento oportuno é interrompida. No presente estudo, é relatada uma técnica única para detectar e medir transmissores de peptídeos in vivo através do uso de um biosensor de imunoprobe capacitivo (sonda CI). O protocolo de fabricação e a caracterização in vitro dessas sondas são descritos. São fornecidas medidas de liberação in vivo de neuropeptídeo evocado por estimulação simpática (NPY). A liberação do NPY está correlacionada com a liberação simpática da norepinefrina para referência. Os dados demonstram uma abordagem para a medição rápida e localizada de neuropeptídeos in vivo. As aplicações futuras incluem avaliação intraoperatória em tempo real da progressão da doença e implantação minimamente invasiva de cateter dessas sondas.

Introduction

Vários métodos químicos para detectar e quantificar biomarcadores são rotineiramente utilizados tanto na química proteica quanto nos diagnósticos clínicos, particularmente nos diagnósticos de câncer e na avaliação da progressão de doenças cardiovasculares. Atualmente, métodos como cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC), ensaio imunosorbente ligado à enzima (ELISA) e espectrometria de massa dependem da coleta de amostras do compartimento vascular ^1,2,3 por extrato de fluido a granel ou do compartimento intersticial por microdiálise. A microdiálise emprega um tubo de membrana semipermeável de comprimento conhecido que é colocado em uma região de interesse. O fluido de coleta é perfundido através do tubo ao longo de vários minutos⁴ para coletar a amostra para análise⁵, limitando assim a resolução temporal. Dessa forma, as amostras coletadas fornecem apenas um valor médio ao longo do tempo do microambiente local e são limitadas pela taxa de perfusão e coleta de volume amostral suficiente. Além disso, esses métodos requerem o agrupamento de dados experimentais e a média de sinais; portanto, eles podem deixar de explicar a variabilidade entre os sujeitos. É importante ressaltar que o tempo entre a coleta amostral e a análise offline subsequente impede a intervenção clínica imediata e a terapêutica.

No presente protocolo, é delineado o uso de um biosensor de imunoprobe capacitivo (teste CI) para a detecção elétrica de peptídeos bioativos específicos. Neuropeptídeo Y (NPY), liberado de neurônios simpáticos pós-gânglios que inervam a vasculatura, endocárdio, cardiomioces e gânglios intracardiac, é um grande transmissor de peptídeos neuromodulatórios no sistema cardiovascular 6,7,8,9. O método aqui apresentado é projetado para medir o NPY, e a viabilidade experimental é demonstrada em um modelo de coração suíno. No entanto, essa abordagem se aplica a qualquer peptídeo bioativo para o qual um anticorpo seletivo esteja disponível¹⁰. Este método conta com a junção capacitiva entre uma sonda de fio de platina e o fluido condutor na ponta funcionalizada^11,12. Nesta aplicação, a interação foi mediada através de um anticorpo contra o neuropeptídeo alvo (NPY), que estava ligado à ponta do eletrodo, interligando o ambiente de fluidos condutivos. Esta funcionalidade foi obtida através da eletrodeposição de polidopamina reativa na ponta da sonda de fio de platina ^10,13.

Quando a sonda funcionalizada por anticorpos é colocada em uma região de interesse em vivo, a liberação endógena do NPY evocada leva à ligação aos anticorpos de captura na ponta da sonda, e o fluido condutor na superfície do eletrodo é deslocado pela proteína NPY. A alteração local no ambiente elétrico resulta no deslocamento de fluido de alta mobilidade e alta dielétrica com uma molécula imóvel e estaticamente carregada. Isso altera a interface eletrodo-fluido e, portanto, sua capacitância, que é medida como uma mudança na corrente de carga em resposta a um potencial de comando passo-função. Um potencial de “reset” negativo é empregado imediatamente após cada ciclo de medição individual para repelir npy vinculado do anticorpo através da interação eletrostática, limpando assim os locais de ligação de anticorpos para rodadas subsequentes de medição¹⁰. Isso efetivamente permite a medição do NPY de forma resolvida no tempo. A técnica de CI única supera as limitações dos métodos imunoquímicos baseados em microdiálise descritos acima para medir os níveis dinâmicos de biomarcadores de um único experimento sem pool de dados ou média de sinais ao longo de vários experimentos⁹, fornecendo dados em tempo quase real. Além disso, a capacidade de adaptar este método a qualquer biomarcador de interesse para o qual existe um anticorpo adequado em escala pontual e localizada proporciona um grande avanço técnico na medição imunoquímica para a avaliação da progressão da doença e orientação de intervenções terapêuticas.

O software para aquisição e análise de dados foi escrito sob medida no IGOR Pro (um ambiente de software totalmente interativo). Um sistema de conversor analógico para digital (A/D) emitiu uma tensão de comando sob controle de computador e adquiriu dados de um amplificador personalizado. O amplificador possuía certas características únicas. Estes incluíram um resistor de feedback (comutação) para cada um dos quatro canais de aquisição, permitindo a escolha de 1 MOhm ou 10 circuitos de retenção de tensão de feedback MOhm para integrar a variabilidade do eletrodo. Uma unidade de palco com uma única cabeça e circuito mútuo de solo/referência para todos os quatro canais de aquisição também foi construída para colocar o dispositivo perto do peito em um único módulo físico. Uma configuração de resistor de feedback de 1 MOhm foi usada para coletar todos os dados relatados.

As configurações de filtro e ganho foram telegrafadas a partir do amplificador e registradas dentro do arquivo de dados. Os dados foram filtrados a 1 kHz através de um filtro Bessel analógico de 2 polos digitalizado a 10 kHz. A diferença de potencial entre a sonda e a solução condutora circundante cria uma camada capacitiva Helmholtz na ponta da sonda. A ligação de ligante ao anticorpo na ponta da sonda resulta em uma carga local alterada e, portanto, uma mudança na capacitância helmholtz. Esta mudança no componente capacitivo do circuito resulta em uma mudança na magnitude da carga injetada necessária para trazer a sonda ao potencial no protocolo de tensão de função de passo. Assim, a vinculação de um ligante específico à sonda funcionalizada resulta em uma alteração na medição da capacitância do eletrodo como uma mudança na corrente capacitiva máxima.

Protocol

Todos os experimentos em animais foram aprovados pela Universidade da Califórnia, Comitê de Pesquisa Animal de Los Angeles e realizados seguindo as diretrizes estabelecidas pelo Guia Nacional de Saúde para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (8ª edição, 2011). Suínos yorkshire machos adultos de aproximadamente 75 kg foram utilizados para estudos in vivo 10. 1. Fabricação e funcionalização do imunoprobe capacitivo Cor…

Representative Results

Fabricação e caracterização de eletrodosUm imunoprobe capacitivo flexível (sondas CI) foi fabricado, e uma imagem representativa é retratada na Figura 1A. O potencial do eletrodo foi definido por um circuito de grampo de tensão controlado por computador (Figura 1B), e o eletrodo foi imerso em uma solução de polidopamina feita em PBS. A polidopamina foi eletrodepositada na ponta do eletrodo condutor13 para fun…

Discussion

O presente protocolo descreve a fabricação e o teste de um imunoprobe capacitivo (teste CI) capaz de detectar e medir biomarcadores de interesse tanto em configurações in vitro quanto in vivo . A detecção é alcançada prendendo o biomarcador na ponta do eletrodo. O evento de captura altera a junção capacitiva entre um imunoprobe capacitivo de fio de platina e o ambiente de fluido condutivo circundante, medido como uma mudança na corrente de carga em resposta a uma possível mudança na sonda. …

Materials

AgCl disc electrode	Warner Instruments (Holliston, MA)	64-1307
Anti-NPY monoclonal antibody	Abcam, (Cambridge, MA)	ab112473
Custom multichannel amplifier/ 1 MΩ feedback resistor multichannel headstage	NPI Electronic, (Tamm, Germany)	NA	Based on NPI VA-10M multichannel amplifier
Dopamine HCl	Sigma Aldrich (St. Louis, MO)	H8502-10G
Gold-plated male connector pin	AMP-TE Connectivity (Amplimite)	6-66506-1
HEKA LIH 8+8 analog-to-digital/digital-to-analog device	HEKA Elektronik, (Holliston, MA)	NA
Igor Pro data acquisition software, v. 7.08	WaveMetrics, (Lake Oswego, OR)		Software driving command potential and data acquisition was custom written
Masterflex L/S Standard Digital peristaltic pump	Cole Palmer, (Vernon Hills, IL)
PFA-coated platinum wire	A-M Systems, (Sequim, WA)	773000	0.005” bare diameter, 0.008” coated diameter
Silicone elastomer	World Precision Instruments (Sarasota, FL)	SYLG184
Synthetic porcine NPY peptide	Bachem (Torrance, CA)	4011654
Synthetic porcine NPY peptide	Bachem (Torrance, CA)	4011654