Differentiel dynamisk mikroskopi (DDM) kombinerer funktioner i dynamisk lysspredning og mikroskopi. Her præsenteres processen med at bruge DDM til at karakterisere rekonstituerede cytoskeletnetværk ved at kvantificere den subdiffusive og burede dynamik af partikler i vimentinnetværk og den ballistiske bevægelse af aktive myosindrevne actin-mikrotubululkompositter.
Celler kan kravle, selvhelbrede og indstille deres stivhed på grund af deres bemærkelsesværdigt dynamiske cytoskelet. Som sådan kan rekonstituerende netværk af cytoskeletale biopolymerer føre til en lang række aktive og tilpasningsdygtige materialer. Imidlertid kræver konstruktion af sådanne materialer med præcist indstillede egenskaber måling af, hvordan dynamikken afhænger af netværkssammensætningen og syntesemetoderne. Kvantificering af en sådan dynamik udfordres af variationer på tværs af tid, rum og formuleringsrum i sammensatte netværk. Protokollen beskriver her, hvordan Fourier-analyseteknikken, differentialdynamisk mikroskopi (DDM), kan kvantificere dynamikken i biopolymernetværk og er særligt velegnet til studier af cytoskeletnetværk. DDM arbejder på tidssekvenser af billeder erhvervet ved hjælp af en række mikroskopimodaliteter, herunder laserscanning confocal, widefield fluorescens og brightfield imaging. Fra sådanne billedsekvenser kan man udtrække karakteristiske dekoderingstider for tæthedsudsving over et spænd af bølgevektorer. En brugervenlig, open source Python-pakke til udførelse af DDM-analyse er også udviklet. Med denne pakke kan man måle dynamikken i mærkede cytoskeletkomponenter eller indlejrede sporpartikler, som demonstreret her med data fra mellemliggende filamentnetværk (vimentin) og aktive actin-mikrotubulusnetværk. Brugere uden forudgående programmerings- eller billedbehandlingserfaring vil være i stand til at udføre DDM ved hjælp af denne softwarepakke og tilhørende dokumentation.
Cytoskelettet er et netværk af proteinfilamenter, der spænder over cytoplasmaet af eukaryote celler, der forbinder celleoverfladen til kernen. Det har unikke materialeegenskaber, der giver mekanisk beskyttelse mod store og gentagne mekaniske belastninger, men også driver dynamiske celleformændringer1. Rekonstituerede cytoskeletnetværk kan give anledning til en række interessante dynamiske adfærd, fra burning af indlejrede partikler til ballistisk bevægelse drevet af molekylære motorer 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11 . Metoder til at analysere dynamikken i sådanne netværk inkluderer sporing af bevægelsen af indlejrede spormikrosfærer 6,7,12,13,14, billedanalyse for at spore størrelsen af proteintætte klynger over tid8, dynamisk lysspredning15, partikelbillede velocimetri 4,16,17,18,19 , beregning af effektspektraltætheden af billeder over tid19 og kymografanalyse20. Efterhånden som flere undersøgelser af rekonstituerede cytoskeletnetværk udføres, hvad enten det er for at forstå cellulær mekanik eller aktivt stof, er robuste, upartiske og reproducerbare metoder til karakterisering af dynamikken i stigende grad nødvendige. Differentiel dynamisk mikroskopi (DDM)21,22, en relativt ny teknik, der er blevet brugt til at studere cytoskeletdynamik, er en sådan teknik, der effektivt kvantificerer dynamik med få brugerdefinerede parametre. Med den softwarepakke, der er beskrevet her, vil forskere med ringe erfaring inden for programmering eller billedanalyse kunne udnytte DDM til deres eget arbejde.
DDM er en billedanalyseteknik til at udtrække en prøves dynamik. Ligesom partikelsporing eller partikelbilledvelocimetri kræver DDM en tidsserie af billeder (ofte tusindvis af billeder), typisk optaget med et mikroskop. I modsætning til partikelsporing behøver individuelle funktioner eller sporperler ikke at være lokaliseret (eller endda være lokaliserelige) i billedet. I modsætning til både partikelsporing og partikelbilledvelocimetri genvinder man ensembledynamikken med DDM med relativt få brugerspecificerede parametre. Med DDM analyseres billeder i Fourier-rummet for at bestemme henfaldstiden for tæthedsudsving over en række bølgetal, q, hvor q = 2πu, og u er størrelsen af de rumlige frekvenser, . Man får spredningslignende oplysninger, men med virkelige rumbilleder erhvervet på et mikroskop 21,22,23. Derfor kan man drage fordel af de forskellige kontrastgenererende metoder til mikroskopi, såsom widefield fluorescens22,24, konfokal fluorescens25, polariseret26, mørkfelt27 eller lysark fluorescens28 mikroskopier. Desuden kan billeder, der anvendes til DDM-analyse, anvendes til partikelsporing eller partikelbilledvelocimetri for at give supplerende information.
Denne kombination af funktioner fra dynamisk lysspredning og optisk mikroskopi gør DDM til en kraftfuld og alsidig teknik. Siden den første beskrivelse af Cerbino og Trappe i 200821, hvor DDM blev påvist at måle diffusionen af 73 nm kolloide partikler, er DDM blevet brugt til at måle flydende kolloider29, kolloid aggregering30,31, viskoelasticiteten af nematiske flydende krystaller26, dynamikken i kolloide geler32, grovskum33, nanopartikler i lukkede miljøer34, 35,36,37, bakteriel motilitet 38,39,40,41, diffusion af svagt spredende proteinklynger 42, kapillærbølger ved væskegrænseflader43 og andre systemer. De, der søger en mere komplet liste over publikationer, der anvender DDM, kan henvise til grundige gennemgangspapirer om emnet 22,23,44,45.
DDM er også blevet brugt til at undersøge dynamikken i biologiske netværk. Drechsler et al. brugte DDM til at måle dynamikken i actin i levende Drosophila oocytter46. Burla et al. kvantificerede dynamikken i sporstofpartikler i netværk af hyaluronan og hyaluronan-kollagenkompositter47. Flere anvendelser af DDM til at studere dynamikken af sporstofpartikler i rekonstituerede cytoskeletnetværk 9,10, transport af DNA-molekyler i sådanne netværk48,49 og dynamikken i aktive rekonstituerede netværk er også dokumenteret 11,50,51. En fordel ved DDM til måling af dynamikken i sådanne systemer er, at individuelle partikler eller molekyler ikke behøver at blive lokaliseret og sporet. Så for eksempel kan dynamikken i DNA-molekyler i overfyldte miljøer måles med DDM på trods af vanskeligheden ved at spore sådanne små og ikke-sfæriske molekyler. Desuden kan man med fluorescensmikroskopi bruge flerfarvet mærkning til selektivt at måle dynamikken i individuelle bestanddele i en kompleks sammensætning.
For at udføre DDM tages en sekvens af billeder over tid, I (x, y, t). For en given forsinkelsestid findes Δt, alle (eller en delmængde af) par billeder adskilt af den pågældende forsinkelsestid. Den kvadrerede Fourier-transformation af forskellen mellem hvert par,
beregnes og beregnes sammen. Denne mængde, , er radialt gennemsnitlig, forudsat at dynamikken er isotrop. Dette giver DDM-matrixen (også kaldet billedstrukturfunktionen),
. Denne proces er vist grafisk i figur 1. For at bestemme prøvens dynamik fra denne DDM-matrix antages DDM-matrixen at have form
hvor A er amplituden, som afhænger af mikroskopets detaljer og prøvens struktur, B er baggrunden, som afhænger af støjen i billederne, og f (q, Δt) er den mellemliggende spredningsfunktion (ISF), som indeholder information om dynamikken21,22. I enkle tilfælde,
hvor τ er en karakteristisk henfalds- eller dekoderingstid. En sådan ISF er blevet anvendt i flere undersøgelser, der anvender DDM på ergodiske systemer som fortyndede kolloide suspensioner 21,24,27,37,40,52. Imidlertid kan andre former for ISF bruges til at modellere forskellige typer dynamikker. For eksempel kan man bruge en cumulant ekspansion til at modellere ISF for polydisperse prøver som
hvor μ er et mål for polydispersiteten42,53; hvis densitetsudsving henfalder med to separate tilstande, kan man bruge en ISF som
26, 54, 55, 56, 57;
andre ISF’er kan anvendes til svømning af mikroorganismer eller andre aktive partikler 38,39,40,41,58,59.
Figur 1: Oversigt over DDM-analyse. Fra tidsserien af billeder beregnes Fourier-transformationen af billedforskelle for at beregne DDM-matrixen. DDM-matrixen kan tilpasses en model for at bestemme tidsskalaen for densitetsudsving over en række q-værdier . Klik her for at se en større version af denne figur.
Her beskrives brugen af en DDM-analysesoftwarepakke udviklet i Python, PyDDM. Denne softwarepakke bygger på det arbejde, der er udført af vores forskningslaboratorier og andre offentliggjorte undersøgelser i løbet af de sidste mange år. Primære motivationsfaktorer for at oprette denne softwarepakke inkluderer behovet for (1) at holde styr på og gemme metadata og parametre, der bruges i analysen; (2) grundig dokumentation med detaljerede eksempler på analyse fra start til slut; og (3) en nem måde at anvende forskellige (eller oprette nye) matematiske modeller til tilpasning af dataene (f.eks. tilføjelse af ISF-modeller, såsom dem, der for nylig er udviklet til aktive filamenter60, ville være ligetil). Der findes også andre softwarepakker til DDM-analyse, men ikke alle er veldokumenterede og skrevet i et open source-programmeringssprog. For eksempel er der C++-kode med computing på GPU’er (https://github.com/peterlu/ConDDM)25, C++-kode, der bruger Fourier-transformationer i tide til at fremskynde beregninger (https://github.com/giovanni-cerchiari/diffmicro)61, MATLAB- og Python-versioner (https://github.com/MathieuLeocmach/DDM)40, MATLAB-kode (https://sites.engineering.ucsb.edu/~helgeson/ddm.html)27 og MATLAB-kode med usikkerhedskvantificering ( https://github.com/UncertaintyQuantification/DDM-UQ)62. Da denne PyDDM-pakke er veldokumenteret og giver en masse fleksibilitet i, hvordan DDM-matrixen beregnes og analyseres, kan den forhåbentlig være nyttig for forskere, der ønsker at implementere DDM uanset deres baggrund i programmering eller billedanalyse.
Protokollen viser, hvordan denne softwarepakke kan bruges til at kvantificere dynamikken i in vitro-rekonstituerede cytoskeletnetværk. Dette gøres ved at bruge to forskellige sæt billeddata: (1) billeder af submikronsporepartikler indlejret i et vimentinnetværk taget med brightfieldmikroskopi og (2) billeder af fluorescerende mærkede actin- og mikrotubulilofilamenter i et sammenfiltret sammensat netværk med myosindrevet aktivitet taget med laserscanning konfokal mikroskopi. Analyserne af disse to datasæt fremhæver bemærkelsesværdige styrker ved DDM, herunder dets evne til at analysere billeder taget med en række billeddannelsesmetoder (f.eks. Brightfield eller konfokal fluorescens), at udtrække dynamik fra enten indlejrede sporstoffer eller fra mærkede filamenter og at kvantificere en række dynamikker (f.eks. Subdiffusive og begrænsede eller ballistiske).
Den softwarepakke, der er beskrevet her, bruger DDM til at analysere tæthedsudsving observeret i billeder erhvervet ved hjælp af et optisk mikroskop. Repræsentative resultater fra data fra sporstofpartikler indlejret i vimentinnetværk blev først vist. Analysen af sådanne data kan bruges til at karakterisere netværkets maskestørrelse og stivhed på samme måde som enkeltpartikelsporing er blevet brugt i mange tidligere undersøgelser af cytoskeletnetværk 6,12,13. En fordel ved at bruge DDM frem for enkeltpartikelsporing er, at DDM ikke kræver, at partiklerne er lokaliserede. Derfor, selv i billeder, hvor partikeltætheden er for høj eller partiklerne for små til at lokalisere og spore, kan DDM stadig bestemme dynamikken. Hvor enkeltpartikelsporing ville være fordelagtig, er ved inspektion af partikel-til-partikelvariation. Med DDM finder man ensemblets gennemsnitlige dynamik, mens man med enkeltpartikelsporing kan beregne både en enkelt partikels MSD og den ensemble-gennemsnitlige MSD. DDM kan dog bruges til at undersøge heterogen dynamik ved at analysere flere regioner af interesse inden for et stort synsfelt.
Dernæst blev der vist repræsentative resultater fra data fra fluorescerende mærkede filamenter i et aktivt netværk sammensat af to forskelligt mærkede cytoskeletale filamenttyper11. Med disse data blev den ballistiske bevægelse karakteriseret uden behov for lokaliserede funktioner i billedet. Da DDM udtrækker ensemblets gennemsnitlige dynamik med få brugerinput, gør det sammenligning af billedserier erhvervet med forskellige forhold ligetil (f.eks. Sammenligning af prøver med forskellige forhold mellem actin og mikrotubuli eller prøver med forskellige koncentrationer af myosin, som gjort i50). Derudover kan vi ved hjælp af fluorescerende billeddannelse undersøge dynamikken i forskellige komponenter i et netværk ved hjælp af flerfarvet mærkning. Dette blev gjort i 11,50, hvor dynamikken i actin og mikrotubuli blev analyseret separat i et aktivt actin-mikrotubuluskompositnetværk ved hjælp af flerfarvet billeddannelse. I afsnittet om repræsentative resultater her blev kun resultaterne fra mikrotubuluskanalen vist, men i tidligere arbejde sammenlignede vi dynamikken i mikrotubulus- og actinfilamenterne11.
Vi bemærker, at disse repræsentative resultater viser enten passiv subdiffusion eller aktiv ballistisk bevægelse. Det er vigtigt, at DDM kan bruges til at analysere systemer, hvor der er en crossover i typen af dynamik på mellemtids- eller længdeskalaer. Som eksempler brugte Kurzthaler et al. DDM med et system af aktive Janus-kolloider til at udforske aktiv rettet bevægelse på korte tidsskalaer og randomisering af orienteringen på længere tidsskalaer59; Giavazzi et al. brugte DDM med et grovskum og fandt en crossover i dynamikken svarende til længdeskalaen for en boble33; og Cho et al. brugte DDM med kolloide geler og fandt tre skelnelige regimer i forskellige længdeskalaer, der spænder fra fraktalklyngerne til hele netværket32.
Dataene i afsnittet om repræsentative resultater blev erhvervet med brightfieldmikroskopi og laserscanning konfokal mikroskopi. Som tidligere nævnt kan DDM imidlertid bruges med mange billeddannelsesmetoder. Med enhver billedbehandlingsmodalitet bør brugerne overveje optiske indstillinger såsom graden af optisk sektionering eller dybdeskarpheden. En høj grad af optisk sektionering kan reducere signalet fra objekter, der er ude af fokus, men man vil ikke være i stand til nøjagtigt at måle dynamik over tidsskalaer, der er større end tidsskalaen for objekter til at bevæge sig ud af dybdeskarpheden25,28. En mere grundig diskussion af, hvordan den q-afhængige dybdeskarphed påvirker DDM-analysen, findes i22. Til brightfield-billeddannelse skal brugerne muligvis også overveje prøvetykkelsen. Mens tykkere prøver for svagt spredte prøver kan give mere signal42, kan uklare prøver kræve ændring af analysen for at tage højde for flere spredning81. Endelig skal man for billeddannelsesmetoder, der ikke er lineære ruminvariante (det vil sige, hvor intensiteten optaget af kameraet af et objekt afhænger af, hvor objektet er i x-y-prøveplanet), muligvis tage højde for den lineære rumvarians, som demonstreret med mørkfelt DDM27.
For dem, der kommer i gang med DDM, ønsker vi at understrege vigtigheden af at overveje den rumlige og tidsmæssige opløsning. Når man inspicerer de bestemte henfaldstider som funktion af bølgetal, er det vigtigt at markere grænserne for ens opløsning (dvs. de maksimale og minimale forsinkelsestider og det maksimale bølgetal, som gjort i figur 5). Man bør tænke nøje over disse grænser, inden man indsamler data, så den optimale objektive linse, billedstørrelse, billedhastighed og filmvarighed kan vælges. Den anden vigtige overvejelse er, hvordan man estimerer baggrundsparameteren B. Der er anvendt flere metoder til at estimere baggrunden i litteraturen, og virkningerne af at over- eller undervurdere B er beskrevet i tidligere publikationer62,77. Som vist i figur 10 giver PyDDM brugerne mulighed for at implementere forskellige metoder til estimering af B, og vi foreslår, at nye brugere prøver disse metoder og evaluerer, hvilke der er passende at bruge.
En styrke ved denne pakke er dens grundige dokumentation og gennemgange med eksempeldata, lagring og organisering af metadata for at holde styr på, hvordan analyser blev udført, og fleksibiliteten i, hvordan man analyserer DDM-matrixen (forskellige tilpasningsmodeller, flere metoder til estimering af baggrundsparameteren B, evnen til at finde MSD). Der er dog flere aspekter af denne kode, der kan forbedres. I øjeblikket er koden ikke optimeret til hurtig beregningshastighed. Metoder til at fremskynde beregningen er blevet rapporteret61,62, og disse vil blive implementeret i fremtidige udgivelser. Derudover planlægger vi at implementere nyligt rapporterede metoder til bedre at estimere usikkerheder og anvende simuleringer til at guide brugerne til den relevante ISF-model62. For andre forbedringer håber vi, at brugerne vil kontakte os med forslag.
The authors have nothing to disclose.
Dele af denne forskning blev finansieret af en National Institutes of Health R15 Award (National Institute of General Medical Sciences award nr. R15GM123420, tildelt R.M.R.-A. og R.J.M.), en Cottrell Scholar Award fra Research Corporation for Science Advancement (pris nr. 27459, tildelt R.J.M.) og et William M. Keck Foundation Research Grant (tildelt R.M.R-A.). GHK anerkender taknemmeligt økonomisk støtte fra det hollandske forskningsråd (NWO; projektnummer VI.C.182.004 i NWO Talent Programme).
CMOS camera, Orca-Flash 4.0 | Hamatsu | ||
F-127 Pluronic | Sigma Aldrich | ||
Jupyter Notebook | |||
Nanodrop | Thermo Fisher | ||
Nikon Ti-Eclipse microscope | Nikon | ||
PLL-PEG-bio | SuSos AG, Dübendorf, Switzerland | ||
Polystyrene beads | Sigma Aldrich | ||
Protein dialysis mini-cassette | Thermo Fisher | ||
PyDDM | University of San Diego | N/A | Open source software available from https://github.com/rmcgorty/PyDDM |