Utilizzo della fetta polmonare tagliata con precisione per studiare la regolazione contrattile delle vie aeree e della muscolatura liscia arteriosa intrapolmonare
Summary
Il presente protocollo descrive la preparazione e l’utilizzo di fette polmonari tagliate con precisione dal topo per valutare la contrattilità delle vie aeree e della muscolatura liscia arteriosa intrapolmonare in un ambiente quasi in vivo .
Abstract
Le cellule muscolari lisce (SMC) mediano la contrazione delle vie aeree e dell’arteria intrapolmonare per modificare rispettivamente la resistenza al flusso d’aria e la circolazione polmonare, svolgendo quindi un ruolo critico nell’omeostasi del sistema polmonare. La deregolamentazione della contrattilità SMC contribuisce a diverse malattie polmonari, tra cui l’asma e l’ipertensione polmonare. Tuttavia, a causa del limitato accesso ai tessuti e della mancanza di sistemi di coltura per mantenere fenotipi SMC in vivo , i meccanismi molecolari alla base della contrattilità SMC deregolata in queste malattie rimangono pienamente identificati. La fetta polmonare a taglio di precisione (PCLS) offre un modello ex vivo che aggira queste difficoltà tecniche. Come sezione di tessuto polmonare vivo e sottile, il PCLS mantiene l’SMC in un ambiente naturale e consente il monitoraggio in situ della contrazione SMC e della segnalazione intracellulare Ca2+ che regola la contrattilità SMC. Qui viene fornito un protocollo dettagliato di preparazione PCLS del topo, che conserva intatte le vie aeree e le arterie intrapolmonari. Questo protocollo prevede due passaggi essenziali prima di sottoporre il lobo polmonare all’affettamento: gonfiare le vie aeree con agarosio a basso punto di fusione attraverso la trachea e riempire i vasi polmonari con gelatina attraverso il ventricolo destro. Il PCLS preparato utilizzando questo protocollo può essere utilizzato per biosaggi per valutare la regolazione contrattile mediata da Ca2+ di SMC sia nelle vie aeree che nei compartimenti arteriosi intrapolmonari. Quando applicato a modelli murini di malattie respiratorie, questo protocollo consente l’indagine funzionale di SMC, fornendo così informazioni sul meccanismo alla base della deregolazione della contrattilità SMC nelle malattie.
Introduction
Le cellule muscolari lisce (SMC) sono un importante tipo di cellula strutturale nel polmone, che risiede principalmente nella parete media delle vie aeree e dei vasi polmonari. Gli SMC si contraggono per alterare il calibro luminale, regolando così l’aria e il flusso sanguigno 1,2. Pertanto, la regolazione contrattile delle SMC è essenziale per mantenere l’omeostasi della ventilazione dell’aria e della circolazione polmonare. Al contrario, la contrattilità Aberrante SMC provoca vie aeree ostruttive o malattie vascolari polmonari come l’asma e l’ipertensione arteriosa polmonare. Tuttavia, la valutazione funzionale delle SMC polmonari è stata messa in discussione da un accesso limitato al tessuto polmonare, in particolare quelle piccole vie aeree e microvasi nella parte distale del polmone 2,3. Le soluzioni attuali ricorrono a saggi indiretti, come la misurazione della resistenza del flusso d’aria da parte di Flexivent per riflettere la costrizione delle vie aeree e il controllo della pressione arteriosa polmonare mediante cateterizzazione del cuore destro per valutare la vasocontrazione polmonare 4,5. Tuttavia, questi saggi indiretti presentano molteplici svantaggi, come essere confusi da fattori strutturali, non riuscire a catturare la diversità spaziale delle vie aeree o delle risposte vascolari nell’intera scala polmonare 6,7 e inadatti allo studio meccanicistico della regolazione contrattile a livello cellulare. Pertanto, per lo studio SMC sono stati applicati approcci alternativi che utilizzano cellule primarie isolate, strisce muscolari trachea/bronchi 8,9 o grandi segmenti vascolari10. Tuttavia, questi metodi hanno anche delle limitazioni. Ad esempio, un rapido adattamento fenotipico delle SMC primarie nella condizione di coltura11,12 rende problematico estrapolare i risultati dalla coltura cellulare alle impostazioni in vivo. Inoltre, il fenotipo contrattile delle SMC nelle vie aeree prossimali isolate o nei segmenti vascolari può non rappresentare le SMC nel polmone distale 6,7. Inoltre, la misurazione della forza muscolare a livello tissutale rimane dissociata dagli eventi molecolari e cellulari che sono essenziali per la comprensione meccanicistica della regolazione contrattile.
La fetta polmonare a taglio di precisione (PCLS), una sezione di tessuto polmonare vivo, fornisce uno strumento ex vivo ideale per caratterizzare le SMC polmonari in un microambiente quasi in vivo (cioè l’architettura e l’interazione multicellulare conservate)13. Da quando i dottori Placke e Fisher hanno introdotto per la prima volta la preparazione di fette polmonari da polmoni di ratto e criceto gonfiati di agarosio negli anni 1980 14,15, questa tecnica è stata continuamente avanzata per fornire AI PCLS una qualità superiore e una maggiore versatilità per la ricerca biomedica. Un miglioramento significativo è il miglioramento della conservazione arteriosa polmonare mediante infusione di gelatina oltre al gonfiaggio polmonare con agarosio attraverso la trachea. Di conseguenza, sia le vie aeree che le arterie polmonari sono mantenute intatte nel PCLS per la valutazione ex vivo 16. Inoltre, il PCLS è praticabile per un tempo prolungato in coltura. Ad esempio, i PCLS di topo non hanno avuto cambiamenti significativi nella vitalità cellulare e nel metabolismo per un minimo di 12 giorni in coltura, oltre a mantenere la contrattilità delle vie aeree fino a 7 giorni17. Inoltre, PCLS mantiene vie aeree o vasi di dimensioni diverse per i test di contrazione e rilassamento. Inoltre, la segnalazione intracellulare Ca2+ delle SMC, il fattore determinante della contrattilità cellulare, può essere dosata con coloranti Reporter Ca2+ ripresi da un microscopio confocale o a 2 fotoni13.
Considerando l’ampia applicazione del modello murino nella ricerca polmonare, qui viene descritto un protocollo dettagliato per la preparazione di PCLS murini con vie aeree intatte e arterie intrapolmonari per la ricerca polmonare ex vivo . Utilizzando i PCLS preparati, abbiamo successivamente dimostrato come valutare le vie aeree e le risposte arteriose polmonari a stimoli costrittivi o rilassanti. Inoltre, viene descritto anche il metodo di caricamento del PCLS con colorante reporter Ca2+ e quindi l’imaging della segnalazione Ca2+ di SMC associati a risposte contrattili o rilassanti.
Protocol
Representative Results
Discussion
La preparazione di PCLS comporta diversi passaggi critici. In primo luogo, è essenziale gonfiare il lobo polmonare in modo omogeneo per evitare la variazione della rigidità dei tessuti da distribuzione irregolare dell’agarosio. Poiché l’agarosio liquido si gelifica rapidamente in cateteri sottili o vie aeree a una temperatura inferiore a 37 °C, il conseguente difetto di riempimento nel campo polmonare distale potrebbe aumentare la disparità di rigidità del tessuto polmonare e causare lacerazione del tessuto durante…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è supportato da sovvenzioni NIH, K08135443 (Y.B), 1R01HL132991 (X.A).
Materials
| 1 mL syringe | BD | 309626 | |
| 15 mL sterile centrifuge tubes | Celltreat | 229411 | |
| 3 mL syringe | BD | 309585 | |
| 50 mL sterile centrifuge tubes | Celltreat | 229422 | |
| Acetyl-beta-methacholine | Millipore Sigma | 62-51-1 | |
| Antibiotic-anitmycotic | Thermo Fisher | 15240-062 | |
| CCD-camera | Nikon | Nikon Ds-Ri2 camera | |
| Cover glassess | Fisher Scientific | 12-548-5CP; 12-548-5PP | |
| Cryogenic vials | Fisher Scientific | 430488 | |
| Custom-built laser scanning confocal microscope | Details in Reference 18 | ||
| DMEM/F12 | Fisher Scientific | MT-10-092-CM | |
| Endothelin 1 | Millipore Sigma | E7764 | |
| Fine dissecting scissor | Fisher Scientific | NC9702861 | |
| Freezing container | Sigma-Aldrich | C1562 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | 9000-70-8 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo Fisher | 14025092 | |
| Hemostatic forcep | Fisher Scientific | 16-100-117 | |
| HEPES | Thermo Fisher | 15630080 | |
| High vaccum silicone grease | Fisher Scientific | 146355d | |
| Isopropyl alcohol | Sigma-Aldrich | W292907-1KG-K | |
| Metal washers | Home Depot Product Authority | 800442 | Everbilt Flat Washers #10 |
| Micro-dissecting forcep | Sigma-Aldrich | F4142 | |
| Needle scalp vein set (25 G) | EXELINT | 26708 | |
| NOC-5 | Cayman Chemical | 16534 | |
| Nylon mesh | Component Supply | U-CMN-300 | |
| Oregon green 488 BAPTA-1 AM | Life Technologies | o-6807 | |
| Phase-contrast microscope | Nikon | Nikon Eclipse TS 100 | |
| Pluronic F-127 | Thermo Fisher | P-6867 | |
| Razor blades | Personna | Personna Double Edge Razor Blades in White Wrapper 100 count | |
| Sulfobromophthalein | Sigma-Aldrich | S0252 | |
| Superglue | Krazy Glue | Krazy Glue, All purpose | |
| Ultrapure low melting point agarose | Thermo Fisher | 16520050 | |
| Vibratome | Precisionary | VF 310-0Z | |
| Vibratome chilling block | Precisionary | SKU-VM-CB12.5-NC | |
| Vibratome specimen tube | Precisionary | SKU VF-SPS-VM-12.5-NC | |
| Y shaped IV catheter | BD | 383336 | BD Saf-T-Intima closed IV catheter |
References
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