RNA的转录后修饰代表了一个未被充分研究的翻译调控层,最近与中枢神经系统可塑性有关。在这里,描述了样品制备和液相色谱 – 串联质谱方法,用于同时表征单个神经元中的许多RNA修饰。
RNA的转录后修饰(PTMs)代表了一种研究不足的机制,涉及中枢神经系统(CNS)翻译的调节。最近的证据表明,特定的神经元RNA修饰与学习和记忆范式有关。不幸的是,用于检测这些表观转录组学特征的传统方法只能表征本体组织中高度丰富的RNA修饰,从而排除了对激活的行为回路中单个神经元可能存在的独特PTM图谱的评估。在该协议中,描述了一种方法 – 通过质谱(SNRMA-MS)进行单神经元RNA修饰分析 – 以同时检测和量化单个神经元中的许多修饰的核糖核苷。该方法使用海洋软体动物 Aplysia californica的单个神经元进行验证,首先对主要的CNS神经节进行手术分离和酶处理以暴露神经元细胞体,然后使用锋利的针头和微量移液管进行手动单神经元分离。接下来,在小体积的缓冲液中对样品进行机械和热处理,以从单个细胞中释放RNA以进行随后的RNA消化。然后使用优化的液相色谱 – 质谱方法鉴定和定量修饰的核苷。SNRMA-MS用于为具有已知形态和功能的 加利福尼亚A. californica 的单个已鉴定神经元建立RNA修饰模式。提出了定性和定量SNRMA-MS的例子,突出了RNA修饰在神经元网络中单个神经元之间的异质分布。
RNA规范核苷的修饰因其在蛋白质翻译调控中的无数作用而日益得到认可。迄今为止,已经报道了150多种独特的RNA修饰,其复杂性范围从甲基化,杂原子添加到与细胞代谢物1,2的偶联。这种扩展的RNA字母表,也称为表观转录组,由酶作家产生,负责改变细胞RNA的稳定性3,折叠4和翻译效率5,6 。选定的RNA修饰也可以 通过 酶解橡皮擦7,8逆转,而其他修饰则附加到RNA亚化学计量9,10,使生物系统中修饰和未修饰的RNA序列变得复杂。
RNA修饰在生物学功能中的重要性表现为修饰在不同器官和组织中的不均匀分布,包括中枢神经系统(CNS)的子区域11。这种化学非均质性与CNS发育12,应激反应13和活性依赖性可塑性14有关。中枢神经系统分区域还包括异质细胞群,其中单个细胞表现出不同的化学特征15,16,17,18。即使是相同类型的单个细胞也可能显示独特的转录组,部分原因是组织微环境19 和随机基因表达20。然而,虽然单细胞转录组的表征有些常规,但没有类似的方法可以建立用于多种RNA修饰的单细胞表观转录组。需要能够分析RNA修饰在单个细胞中的分布的新方法,以全面分析CNS和其他生物系统中转录后修饰(PTM)的细胞异质性和调节影响。
使用液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)技术可以很容易地同时测量大容量细胞/组织中的多种RNA修饰。对于修饰核糖核苷的LC-MS / MS分析,从细胞(通常为103-10 6个细胞)中提取RNA,通过沉淀和重悬纯化,随后消化成核苷。然后将由规范和修饰核苷组成的样品混合物注入LC-MS系统以进行分析物分离和检测,从而测定生物体21,22,23中RNA修饰的完整补体。LC-MS / MS最近用于确定神经生物学模型Aplysia californica(A. californica)的CNS中的26个RNA修饰。其中一些表转转录标记的丰度表现出与动物行为变化相关的时间和区域依赖性动态24。然而,由于该方法的灵敏度有限,只能在含有>103个细胞的本体样品中检测RNA修饰。这些较大的样品可能隐藏了具有群体平均值的单个细胞的独特且功能上重要的RNA修饰图谱。尽管对样品制备条件的仔细控制提高了小体积样品中RNA修饰的检测限25,26,27,28,但仍然需要能够检测和定量单个细胞中多个修饰核糖核苷的分析方法。
该协议通过质谱(SNRMA-MS)引入了单神经元RNA修饰分析,允许从 A. californica29的CNS中检测单个神经元中的十几个RNA修饰。该方法包括从主要的CNS神经节中手术分离单个已鉴定的细胞,然后优化样品制备工作流程,涉及机械细胞裂解,RNA变性和在MS兼容的缓冲液中酶水解。SNRMA-MS通过促进单个神经元的转录后RNA修饰谱的获取,满足了RNA修饰分析领域未满足的需求,并具有未来应用于其他细胞类型的潜力。
SNRMA-MS利用优化的样品制备方法,从而产生小的,与MS兼容的样品体积,可以输送到LC-MS平台。中枢神经系统神经节的初始酶预处理决定了它们脱鞘的难易程度和分离期间单个神经元的耐久性。脑神经节通常需要延长酶治疗,因为与颊神经节、胸膜和腹部神经节相比,其鞘相对较厚。执行单个神经元分离的个体研究人员可能对使用微剪刀和细镊子时鞘的耐用性有不同的偏好。然而,重要的是神经节不要过度消化,因为这可能导致其结构完整性的丧失,对识别靶细胞至关重要的位置信息的丧失和/或细胞裂解。从神经节分离后,重要的是要确保在将神经元转移到样品管时吸出最小体积的分离培养基。ASW培养基含有高浓度的盐,在RNA水解过程中可能会干扰消化酶,并且还会稀释样品。
在机械裂解步骤中,大神经元(直径>250μm)在反复通过微量移液管时破裂是很常见的。较小的神经元可能需要额外的注意来确保细胞裂解,这通常涉及在细胞上按压玻璃毛细管。在这种情况下,由于毛细管力,样品缓冲液的部分体积可能会被吸入毛细管中。通过对玻璃毛细管末端施加压力,该体积可以输送回样品管中,以确保不会丢失样品。
通过在添加用于RNA消化的酶之前包括加热步骤,可以获得最佳结果。这可能是因为在95°C下加热会使RNA二级结构变性,这可能会阻碍RNases35 的活性并减少RNA生物聚合物释放的核苷量。先前使用用稳定同位素标记的蛋氨酸加标的样品进行对照实验,以研究热诱导的RNA修饰伪影是否是相对于无热SNRMA-MS方案29观察到的RNA修饰峰面积增加的原因。没有观察到这样的标记,表明使用优化的SNRMA-MS方法进行RNA修饰的改善信号是由于RNA的优越消化。
从细胞中分离总RNA的传统方法包括使用苯酚 – 氯仿进行液-液萃取(LLE)以及随后的RNA沉淀,洗涤和重悬。这些方法已被证明可用于逆转录聚合酶链反应实验,其中选择基因的表达可以很容易地监测已鉴定的 A. californica 神经元36,37。然而,LLE方法不能回收足够的RNA用于通过LC-MS检测修饰的核糖核苷,而本文描述的SNRMA-MS方法能够检测许多RNA修饰29。为了评估本体组织/细胞样品中特定RNA类型(例如,rRNA,tRNA,mRNA)的修饰谱,阴离子交换固相提取24,基于杂交探针的富集38和色谱分离39 方法已被应用,但尚未使用类似的方法用于单细胞RNA纯化。能够从单细胞中分离特定RNA类型的RNA分馏方法的发展将为RNA修饰的功能提供额外的见解。
SNRMA-MS揭示了以前在 加利福尼亚猪笼草 中单个神经元的RNA修饰景观中未表征的异质性,并且可以想象哺乳动物细胞中存在类似不同的PTM图谱。由于与在该协议中分析的大型 A. californica 神经元相比,哺乳动物细胞相对较小,因此需要改进小样本量的处理以促进较低的检测限。虽然目前SNRMA-MS的体积限制为~5μL,但通过将微流体液体处理设备纳入工作流程,可以实现实质性的改进。此外,实施自动或半自动细胞分离将提高样品通量,并允许对较大的细胞群进行单细胞RNA修饰分析。通过与纳米流LC分离27接口,可以实现在更小的细胞中表征表转转录标记。
The authors have nothing to disclose.
这项工作由国家药物滥用研究所资助,奖号为。P30DA018310和国家人类基因组研究所的奖励号为。RM1HG010023.K.D.C.感谢贝克曼研究所博士后奖学金的支持。内容完全由作者负责,并不一定代表资助机构的官方观点。
Animals | |||
Aplysia californica | National Resource for Aplysia (Miami, FL) | 150–250 g (adult) | |
Benchtop equipment | |||
Glass capillary puller | Sutter | P-97 | Equipped with online degasser, autosampler, and thermostatted column compartment |
Milli-Q water purification system | Millipore | Equipped with ESI source | |
Minicentrifuge for PCR tubes | LW Scientific | ZS-1 | |
Optical Microscope | Zeiss | Stemi 2000C | |
Thermocycler | Techne | EW-93945-01 | |
HPLC column and consumables | |||
Acclaim RSLC 120 C18 column | Thermo Scientific | 71399 | |
Autosampler vials | Thermo Scientific | C4011-13 | |
LC and MS Instrumentation and Software | |||
DataAnalysis 4.4 software | Bruker | ||
Dionex Ultimate 3000 nanoLC | Thermo Scientific | ||
Impact HD UHR QqTOF mass spectrometer | Bruker | ||
RStudio | RStudio | ||
Microdissection tools | |||
Microscissors extra fine vannas 3.5” | Roboz | RS-5640 | |
Tungsten needles | Roboz | RS-6065 | |
Reagents/Materials | |||
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethane-sulfonic acid (HEPES) | Fisher Scientific | H3375 | |
Alkaline phosphatase | Worthington Biochemical Corp. | LS004081 | |
Ammonium acetate | Honeywell | 17836 | |
benzonase (endonuclease from S. marcescens) | EMD Millipore | 70746-4 | |
bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
calcium chloride | Sigma-Aldrich | C4901 | |
gentamycin sulfate | Fisher Scientific | G1264 | |
Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M9272 | |
magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | 208094 | |
nucleosides test mix | Sigma-Aldrich | 47310-U | |
penicillin G | Sigma-Aldrich | P7794 | |
pentostatin | Sigma-Aldrich | SML0508 | |
phosphodiesterase I | Worthington Biochemical Corp. | LS003926 | |
protease type XIV from Streptomyces griseus | Sigma-Aldrich | P5147 | |
sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | |
Standard glass capillaries | A-M Systems | 626000 | 1 mm o.d., 0.5 mm i.d., 4 in |
streptomycin sulfate | Sigma-Aldrich | S9137 |