आरएनए के पोस्ट-ट्रांसक्रिप्शनल संशोधन अनुवाद विनियमन की एक समझदार परत का प्रतिनिधित्व करते हैं जिसे हाल ही में केंद्रीय तंत्रिका तंत्र प्लास्टिसिटी से जोड़ा गया है। यहां, नमूना तैयारी और तरल क्रोमैटोग्राफी-अग्रानुक्रम मास स्पेक्ट्रोमेट्री दृष्टिकोण को एकल न्यूरॉन्स में कई आरएनए संशोधनों के एक साथ लक्षण वर्णन के लिए वर्णित किया गया है।
आरएनए के पोस्ट-ट्रांसक्रिप्शनल संशोधन (पीटीएम) केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) में अनुवाद के विनियमन में शामिल एक समझदार तंत्र का प्रतिनिधित्व करते हैं। हाल के साक्ष्य ने विशिष्ट न्यूरोनल आरएनए संशोधनों को सीखने और स्मृति प्रतिमानों से जोड़ा है। दुर्भाग्य से, इन एपिट्रांसक्रिप्टोमिक विशेषताओं का पता लगाने के लिए पारंपरिक तरीके केवल थोक ऊतकों में अत्यधिक प्रचुर मात्रा में आरएनए संशोधनों की विशेषता में सक्षम हैं, जो अद्वितीय पीटीएम प्रोफाइल के मूल्यांकन को रोकते हैं जो सक्रिय व्यवहार सर्किट के भीतर व्यक्तिगत न्यूरॉन्स के लिए मौजूद हो सकते हैं। इस प्रोटोकॉल में, मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एसएनआरएमए-एमएस) द्वारा एकल-न्यूरॉन आरएनए संशोधन विश्लेषण का वर्णन किया गया है– एक साथ एकल न्यूरॉन्स में कई संशोधित राइबोन्यूक्लियोसाइड्स का पता लगाने और मात्रा निर्धारित करने के लिए। समुद्री मोलस्क, एप्लिसिया कैलिफोर्निका के व्यक्तिगत न्यूरॉन्स का उपयोग करके दृष्टिकोण को मान्य किया जाता है, जो न्यूरॉन सेल निकायों को उजागर करने के लिए प्रमुख सीएनएस गैन्ग्लिया के सर्जिकल अलगाव और एंजाइमेटिक उपचार से शुरू होता है, इसके बाद तेज सुइयों और माइक्रोपिपेट का उपयोग करके मैनुअल सिंगल-न्यूरॉन अलगाव होता है। अगला, बफर की एक छोटी मात्रा में नमूने का यांत्रिक और थर्मल उपचार बाद के आरएनए पाचन के लिए एक व्यक्तिगत सेल से आरएनए को मुक्त करने के लिए किया जाता है। संशोधित न्यूक्लियोसाइड को तब एक अनुकूलित तरल क्रोमैटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री विधि का उपयोग करके पहचाना और मात्रा निर्धारित की जाती है। एसएनआरएमए-एमएस को एकल, पहचाने गए न्यूरॉन्स के लिए आरएनए संशोधन पैटर्न स्थापित करने के लिए नियोजित किया जाता है ए कैलिफोर्निका जो रूपात्मकता और कार्यों को जानते हैं। गुणात्मक और मात्रात्मक एसएनआरएमए-एमएस के उदाहरण प्रस्तुत किए जाते हैं जो न्यूरोनल नेटवर्क में व्यक्तिगत न्यूरॉन्स में आरएनए संशोधनों के विषम वितरण को उजागर करते हैं।
आरएनए के विहित न्यूक्लियोसाइड में संशोधन प्रोटीन अनुवाद के नियमन में उनकी असंख्य भूमिकाओं के लिए तेजी से मान्यता प्राप्त है। आज तक 150 से अधिक अद्वितीय आरएनए संशोधनों की सूचना दी गई है कि मिथाइलेशन, हेटेरोएटम जोड़, सेलुलर मेटाबोलाइट्स 1,2 के साथ संयुग्मन तक जटिलता में सीमा है। यह विस्तारित आरएनए वर्णमाला, जिसे एपिट्रांसक्रिप्टोम के रूप में भी जाना जाता है, एंजाइमी लेखकों द्वारा उत्पन्न होता है और सेलुलर आरएनए की स्थिरता3, तह4 और अनुवाद दक्षता 5,6 को बदलने के लिए जिम्मेदार है। चुनिंदा आरएनए संशोधनों को एंजाइमेटिक इरेज़र 7,8 के माध्यम से भी उलट दिया जा सकता है, जबकि अन्य को आरएनए सबस्टोइकोमेट्रिक रूप से 9,10 में जोड़ा जाता है, जो जैविक प्रणालियों में संशोधित और असंशोधित आरएनए अनुक्रमों का एक जटिल परिदृश्य प्रदान करता है।
जैविक कार्य में आरएनए संशोधनों के महत्व को केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) 11 के उपक्षेत्रों सहित विभिन्न अंगों और ऊतकों में संशोधनों के असमान वितरण द्वारा इंगित किया जाता है। इस रासायनिक विषमता को सीएनएस विकास12, तनाव प्रतिक्रिया13 और गतिविधि-निर्भर प्लास्टिसिटी14 से जोड़ा गया है। सीएनएस उपक्षेत्रों में कोशिकाओं की विषम आबादी शामिल है जिसमें व्यक्तिगत कोशिकाएं अलग-अलग रासायनिक प्रोफाइल 15,16,17,18 प्रदर्शित करती हैं। यहां तक कि एक ही प्रकार की एकल कोशिकाएं ऊतक माइक्रोएनवायरनमेंट19 और स्टोकेस्टिक जीन अभिव्यक्ति20 के कारण भाग में अद्वितीय ट्रांसक्रिप्टोम प्रदर्शित कर सकती हैं। हालांकि, जबकि एकल-सेल ट्रांसक्रिप्टोम का लक्षण वर्णन कुछ हद तक नियमित है, कई आरएनए संशोधनों के लिए एकल-सेल एपिट्रांसक्रिप्टोम स्थापित करने के लिए कोई अनुरूप तरीके नहीं हैं। सीएनएस और अन्य जैविक प्रणालियों में पोस्ट-ट्रांसक्रिप्शनल संशोधनों (पीटीएम) के सेलुलर विषमता और नियामक प्रभाव के व्यापक विश्लेषण के लिए व्यक्तिगत कोशिकाओं में आरएनए संशोधनों के वितरण की रूपरेखा तैयार करने में सक्षम नए दृष्टिकोण की आवश्यकता होती है।
ऊतकों में कई आरएनए संशोधनों का एक साथ माप तरल क्रोमैटोग्राफी-अग्रानुक्रम मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एलसी-एमएस / एमएस) तकनीकों का उपयोग करके आसानी से पूरा किया जाता है। संशोधित राइबोन्यूक्लियोसाइड्स के एलसी-एमएस / एमएस विश्लेषण के लिए, आरएनए कोशिकाओं (आमतौर पर 103-10 6 कोशिकाओं) से निकाला जाता है, वर्षा और पुन: निलंबन द्वारा शुद्ध किया जाता है, और बाद में न्यूक्लियोसाइड में पच जाता है। विहित और संशोधित न्यूक्लियोसाइड से युक्त नमूना मिश्रण को विश्लेषण पृथक्करण और पता लगाने के लिए एलसी-एमएस प्रणाली में इंजेक्ट किया जाता है, जिससे एक जीव 21,22,23 में आरएनए संशोधनों के पूर्ण पूरक का निर्धारण होता है। एमएस का उपयोग हाल ही में न्यूरोबायोलॉजिकल मॉडल, एप्लिसिया कैलिफोर्निका (ए कैलिफोर्निका) के सीएनएस में 26 आरएनए संशोधनों को निर्धारित करने के लिए किया गया था। इनमें से कुछ एपिट्रांसक्रिप्टोमिक चिह्नों की बहुतायत ने समय- और क्षेत्र-निर्भर गतिशीलता का प्रदर्शन किया जो जानवर24 में व्यवहार परिवर्तन के साथ सहसंबद्ध था। हालांकि, विधि की सीमित संवेदनशीलता के कारण >103 कोशिकाओं वाले थोक नमूनों में आरएनए संशोधनों का पता लगाना केवल संभव था। इन बड़े नमूनों ने जनसंख्या औसत के साथ व्यक्तिगत कोशिकाओं के अद्वितीय और कार्यात्मक रूप से महत्वपूर्ण आरएनए संशोधन प्रोफाइल को छिपाया। यद्यपि नमूना तैयारी की स्थिति के सावधानीपूर्वक नियंत्रण ने छोटी मात्रा के नमूनों 25,26,27,28 में आरएनए संशोधनों के लिए पता लगाने की सीमा में सुधार किया है, विश्लेषणात्मक तरीकों की आवश्यकता बनी हुई है जो एकल कोशिकाओं में कई संशोधित राइबोन्यूक्लियोसाइड्स का पता लगा सकते हैं और मात्रा निर्धारित कर सकते हैं।
यह प्रोटोकॉल मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एसएनआरएमए-एमएस) द्वारा एकल-न्यूरॉन आरएनए संशोधन विश्लेषण का परिचय देता है, जो ए कैलिफोर्निका29 के सीएनएस से एकल न्यूरॉन्स में एक दर्जन से अधिक आरएनए संशोधनों का पता लगाने की अनुमति देता है। दृष्टिकोण में प्रमुख सीएनएस गैन्ग्लिया से एकल, पहचानी गई कोशिकाओं के सर्जिकल अलगाव के बाद एक अनुकूलित नमूना तैयारी वर्कफ़्लो होता है जिसमें एमएस-संगत बफर में यांत्रिक सेल लाइसिस, आरएनए विकृतीकरण और एंजाइमी हाइड्रोलिसिस शामिल होता है। एमएस का उपयोग करके पोस्ट-ट्रांसक्रिप्शनल रूप से संशोधित न्यूक्लियोसाइड्स की पहचान और मात्रा का ठहराव तब पूरा किया जाता है एसएनआरएमए-एमएस एकल न्यूरॉन्स के लिए पोस्ट-ट्रांसक्रिप्शनल आरएनए संशोधन प्रोफाइल के अधिग्रहण की सुविधा प्रदान करके आरएनए संशोधन विश्लेषण के क्षेत्र में एक अपूर्ण आवश्यकता को पूरा करता है और अन्य सेल प्रकारों के लिए भविष्य के आवेदन की क्षमता रखता है।
एसएनआरएमए-एमएस एक अनुकूलित नमूना तैयारी दृष्टिकोण का लाभ उठाता है, जिसके परिणामस्वरूप एक छोटा, एमएस-संगत नमूना वॉल्यूम होता है जिसे एलसी-एमएस प्लेटफॉर्म पर पहुंचाया जा सकता है। सीएनएस गैन्ग्लिया का प्रारंभिक एंजाइमेटिक प्री-ट्रीटमेंट दोनों को उस आसानी से निर्धारित करता है जिसके साथ उन्हें अलग किया जा सकता है और अलगाव के दौरान एकल न्यूरॉन्स का स्थायित्व। सेरेब्रल गैंग्लियन को अक्सर बुक्कल, फुफ्फुस और पेट गैन्ग्लिया की तुलना में अपेक्षाकृत मोटी म्यान के कारण विस्तारित एंजाइमी उपचार की आवश्यकता होती है। एकल न्यूरॉन अलगाव करने वाले व्यक्तिगत शोधकर्ताओं की अलग-अलग प्राथमिकताएं हो सकती हैं कि माइक्रोसिसर और ठीक संदंश का उपयोग करते समय म्यान कितना टिकाऊ होना चाहिए। हालांकि, यह महत्वपूर्ण है कि गैन्ग्लिया अधिक पचा नहीं है, क्योंकि इससे उनकी संरचनात्मक अखंडता में नुकसान हो सकता है, स्थितीय जानकारी का नुकसान हो सकता है जो लक्ष्य कोशिकाओं की पहचान करने के लिए महत्वपूर्ण है, और / नाड़ीग्रन्थि से अलगाव के बाद, यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि न्यूरॉन को नमूना ट्यूब में स्थानांतरित करते समय अलगाव माध्यम की न्यूनतम मात्रा आकांक्षा की जाती है। एएसडब्ल्यू माध्यम में लवण की एक उच्च सांद्रता होती है जो आरएनए हाइड्रोलिसिस के दौरान पाचन एंजाइमों में हस्तक्षेप कर सकती है और नमूने को भी पतला कर देगी।
यांत्रिक लसीका चरण के दौरान, बड़े न्यूरॉन्स (>250 μm व्यास) के लिए बार-बार माइक्रोपिपेट से गुजरने पर टूटना आम है। छोटे न्यूरॉन्स को सेल लिसिस सुनिश्चित करने के लिए अतिरिक्त ध्यान देने की आवश्यकता हो सकती है, जिसमें आमतौर पर सेल पर एक ग्लास केशिका दबाना शामिल होता है। इस उदाहरण में, यह संभव है कि नमूना बफर की आंशिक मात्रा केशिका बलों के कारण केशिका में खींची जाएगी। यह मात्रा ग्लास केशिका के अंत में दबाव लागू करके नमूना ट्यूब में वापस वितरित की जा सकती है ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि कोई नमूना खो न जाए।
आरएनए पाचन के लिए एंजाइमों को जोड़ने से पहले हीटिंग चरण को शामिल करके सर्वोत्तम परिणाम प्राप्त किए जाते हैं। ऐसा इसलिए है क्योंकि 95 डिग्री सेल्सियस पर हीटिंग आरएनए माध्यमिक संरचनाओं को विकृत करती है जो आरएनए35 की गतिविधि को बाधित कर सकती है और आरएनए बायोपॉलिमर से जारी न्यूक्लियोसाइड की मात्रा को कम कर सकती है। स्थिर आइसोटोप-लेबल वाले मेथियोनीन के साथ नुकीले नमूनों का उपयोग करके नियंत्रण प्रयोगों को पहले यह जांचने के लिए किया गया था कि क्या गर्मी से प्रेरित आरएनए संशोधन कलाकृतियां नो-हीट एसएनआरएमए-एमएस प्रोटोकॉल29 के सापेक्ष आरएनए संशोधनों के लिए देखे गए बढ़े हुए शिखर क्षेत्रों का कारण थीं। ऐसी कोई लेबलिंग नहीं देखी गई, यह दर्शाता है कि अनुकूलित एसएनआरएमए-एमएस विधि का उपयोग करके आरएनए संशोधनों के लिए बेहतर संकेत आरएनए के बेहतर पाचन के कारण थे।
कोशिकाओं से कुल आरएनए को अलग करने के पारंपरिक तरीकों में फिनोल-क्लोरोफॉर्म और बाद में आरएनए वर्षा, धोने और पुन: निलंबन के साथ तरल-तरल निष्कर्षण (एलएलई) शामिल है। ये दृष्टिकोण रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन प्रयोगों के लिए उपयोगी साबित हुए हैं जहां चयनित जीनों की अभिव्यक्ति की पहचान ए कैलिफोर्निका न्यूरॉन्स36,37 में आसानी से निगरानी की जा सकती है। हालांकि, एलएलई विधियां एलसी-एमएस द्वारा संशोधित राइबोन्यूक्लियोसाइड्स का पता लगाने के लिए पर्याप्त आरएनए को पुनर्प्राप्त नहीं कर सकती हैं, जबकि यहां वर्णित एसएनआरएमए-एमएस विधि कई आरएनए संशोधनों का पता लगाने में सक्षम बनाती है। सेल नमूनों में विशिष्ट आरएनए प्रकारों (जैसे, आरआरएनए, टीआरएनए, एमआरएनए) के संशोधन प्रोफाइल का आकलन करने के लिए, आयनों-विनिमय ठोस चरण निष्कर्षण24, संकरण जांच-आधारित संवर्धन38, और क्रोमैटोग्राफिक विभाजन39 दृष्टिकोण लागू किए गए हैं, लेकिन एकल-कोशिका आरएनए शुद्धिकरण के लिए समान तरीके अभी तक उपलब्ध नहीं हैं। आरएनए विभाजन दृष्टिकोण का विकास जो एकल कोशिकाओं से विशिष्ट आरएनए प्रकारों को अलग करने में सक्षम हैं, आरएनए संशोधनों के कार्य की ओर अतिरिक्त अंतर्दृष्टि प्रदान करेगा।
एसएनआरएमए-एमएस ने ए कैलिफोर्निका में एकल न्यूरॉन्स के आरएनए संशोधन परिदृश्य में पहले से अनिर्दिष्ट विषमता का खुलासा किया और यह कल्पनीय है कि स्तनधारी कोशिकाओं में इसी तरह के अलग-अलग पीटीएम प्रोफाइल मौजूद हैं। स्तनधारी कोशिकाओं इस प्रोटोकॉल में विश्लेषण बड़े ए कैलिफोर्निका न्यूरॉन्स की तुलना में अपेक्षाकृत छोटे हैं, क्योंकि छोटे नमूना संस्करणों की हैंडलिंग में सुधार कम पता लगाने की सीमा की सुविधा के लिए आवश्यक हैं। यद्यपि वर्तमान में एसएनआरएमए-एमएस ~ 5 μL की मात्रा तक सीमित है, यह उम्मीद की जाती है कि वर्कफ़्लो में माइक्रोफ्लुइडिक तरल हैंडलिंग उपकरणों को शामिल करके पर्याप्त सुधार प्राप्त किए जा सकते हैं। इसके अलावा, स्वचालित या अर्ध-स्वचालित सेल अलगाव के कार्यान्वयन से नमूना थ्रूपुट में वृद्धि होगी और बड़ी सेल आबादी के एकल-सेल आरएनए संशोधन विश्लेषण की अनुमति मिलेगी। नैनोफ्लो एलसी पृथक्करण27 के साथ इंटरफेसिंग करके, यहां तक कि छोटी कोशिकाओं में एपिट्रांसक्रिप्टोमिक चिह्नों का लक्षण वर्णन प्राप्त करने योग्य होगा।
The authors have nothing to disclose.
इस कार्य को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑन ड्रग एब्यूज द्वारा अवार्ड नं. पी30डीए018310 और राष्ट्रीय मानव जीनोम अनुसंधान संस्थान पुरस्कार सं. आरएम 1 एचजी010023। केडीसी बेकमैन इंस्टीट्यूट पोस्टडॉक्टरल फैलोशिप से समर्थन स्वीकार करता है। सामग्री पूरी तरह से लेखकों की जिम्मेदारी है और जरूरी नहीं कि वित्त पोषण एजेंसियों के आधिकारिक विचारों का प्रतिनिधित्व करती है।
Animals | |||
Aplysia californica | National Resource for Aplysia (Miami, FL) | 150–250 g (adult) | |
Benchtop equipment | |||
Glass capillary puller | Sutter | P-97 | Equipped with online degasser, autosampler, and thermostatted column compartment |
Milli-Q water purification system | Millipore | Equipped with ESI source | |
Minicentrifuge for PCR tubes | LW Scientific | ZS-1 | |
Optical Microscope | Zeiss | Stemi 2000C | |
Thermocycler | Techne | EW-93945-01 | |
HPLC column and consumables | |||
Acclaim RSLC 120 C18 column | Thermo Scientific | 71399 | |
Autosampler vials | Thermo Scientific | C4011-13 | |
LC and MS Instrumentation and Software | |||
DataAnalysis 4.4 software | Bruker | ||
Dionex Ultimate 3000 nanoLC | Thermo Scientific | ||
Impact HD UHR QqTOF mass spectrometer | Bruker | ||
RStudio | RStudio | ||
Microdissection tools | |||
Microscissors extra fine vannas 3.5” | Roboz | RS-5640 | |
Tungsten needles | Roboz | RS-6065 | |
Reagents/Materials | |||
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethane-sulfonic acid (HEPES) | Fisher Scientific | H3375 | |
Alkaline phosphatase | Worthington Biochemical Corp. | LS004081 | |
Ammonium acetate | Honeywell | 17836 | |
benzonase (endonuclease from S. marcescens) | EMD Millipore | 70746-4 | |
bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
calcium chloride | Sigma-Aldrich | C4901 | |
gentamycin sulfate | Fisher Scientific | G1264 | |
Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M9272 | |
magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | 208094 | |
nucleosides test mix | Sigma-Aldrich | 47310-U | |
penicillin G | Sigma-Aldrich | P7794 | |
pentostatin | Sigma-Aldrich | SML0508 | |
phosphodiesterase I | Worthington Biochemical Corp. | LS003926 | |
protease type XIV from Streptomyces griseus | Sigma-Aldrich | P5147 | |
sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | |
Standard glass capillaries | A-M Systems | 626000 | 1 mm o.d., 0.5 mm i.d., 4 in |
streptomycin sulfate | Sigma-Aldrich | S9137 |