Eine Gewebereinigungsmethode für die neuronale Bildgebung von der mesoskopischen bis zur mikroskopischen Skala
Summary
Das Protokoll bietet eine detaillierte Methode der neuronalen Bildgebung in Gehirnschnitten unter Verwendung einer Gewebereinigungsmethode, ScaleSF. Das Protokoll umfasst die Vorbereitung des Hirngewebes, die Gewebeklärung, die Handhabung von abgeräumten Schnitten und die konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie-Bildgebung neuronaler Strukturen von mesoskopischer bis mikroskopischer Ebene.
Abstract
Hier wird ein detailliertes Protokoll bereitgestellt, um neuronale Strukturen von mesoskopischen bis hin zu mikroskopischen Ebenen im Hirngewebe sichtbar zu machen. Neuronale Strukturen, die von neuronalen Schaltkreisen bis hin zu subzellulären neuronalen Strukturen reichen, werden in Maus-Gehirnschnitten visualisiert, die mit ScaleSF optisch gelöscht wurden. Diese Clearing-Methode ist eine modifizierte Version von ScaleS und ist eine hydrophile Gewebereinigungsmethode für Gewebeschnitte, die eine starke Clearing-Fähigkeit sowie ein hohes Maß an Erhaltung von Fluoreszenzsignalen und struktureller Integrität erreicht. Eine anpassbare dreidimensionale (3D)-gedruckte Bildgebungskammer wurde für die zuverlässige Montage von gereinigtem Hirngewebe entwickelt. Mäusegehirne, denen ein Adeno-assoziierter Virusvektor injiziert wurde, der ein verbessertes grün fluoreszierendes Proteingen trägt, wurden mit 4% Paraformaldehyd fixiert und mit einem vibrierenden Gewebeschneider in Scheiben von 1 mm Dicke geschnitten. Die Gehirnschnitte wurden unter Befolgung des Clearing-Protokolls gereinigt, das sequentielle Inkubationen in drei Lösungen, nämlich Sca l eS0-Lösung, Phosphatpufferkochsalzlösung (–) und ScaleS4-Lösung, für insgesamt 10,5-14,5 h umfasst. Die gereinigten Hirnschnitte wurden auf die Bildgebungskammer montiert und in 1,5%iges Agarosegel eingebettet, gelöst in ScaleS4D25(0)-Lösung. Die 3D-Bildaufnahme der Scheiben erfolgte mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop, das mit einem Multi-Immersionsobjektiv mit großem Arbeitsabstand ausgestattet war. Beginnend mit der mesoskopischen neuronalen Bildgebung ist es uns gelungen, feine subzelluläre neuronale Strukturen, wie dendritische Stacheln und axonale Boutons, in den optisch gereinigten Hirnschnitten sichtbar zu machen. Dieses Protokoll würde das Verständnis neuronaler Strukturen von Schaltkreis- bis hin zu subzellulären Komponentenskalen erleichtern.
Introduction
Gewebereinigungsmethoden haben die tiefenunabhängige Bildgebung biologischer und klinischer Proben mit Lichtmikroskopie verbessert, so dass strukturelle Informationen über intaktes Gewebe extrahiert werdenkönnen 1,2. Optische Clearing-Techniken könnten möglicherweise auch die Kosten für die histologische Analyse beschleunigen und senken. Derzeit stehen drei Hauptclearing-Ansätze zur Verfügung: hydrophile, hydrophobe und hydrogelbasierte Methoden 1,2. Hydrophile Ansätze übertreffen die Fluoreszenzsignale und die Gewebeintegrität und sind im Vergleich zu den beiden anderen Ansätzen weniger toxisch 3,4.
Eine hydrophile Clearingmethode, ScaleS, nimmt mit ihrer Erhaltung der strukturellen und molekularen Integrität sowie der starken Clearingfähigkeit (Clearing-Konservierungsspektrum) eine herausragende Position ein5. In einer früheren Studie haben wir ein schnelles und isometrisches Clearing-Protokoll, Sca l eSF, für Gewebeschnitte (~ 1 mm Dicke) entwickelt, indem wir das Clearingverfahrenvon ScaleS6 modifiziert haben. Dieses Clearing-Protokoll erfordert sequentielle Inkubationen von Gehirnschnitten in drei Lösungen für 10,5-14,5 h. Die Methode zeichnet sich durch ein hohes Clearing-Konservierungsspektrum aus, das sogar mit der elektronenmikroskopischen (EM) Analyse kompatibel ist (Ergänzende Abbildung 1), was eine hochauflösende dreidimensionale (3D) Multiskalen-Bildgebung mit genauer Signalrekonstruktionermöglicht 6. Daher sollte ScaleSF vor allem im Gehirn wirksam sein, wo neuronale Zellen überschwängliche Prozesse von enormer Länge ausarbeiten und spezialisierte feine subzelluläre Strukturen zum Senden und Empfangen von Informationen anordnen. Die Extraktion struktureller Informationen mit Skalen von Schaltkreis- bis subzellulären Ebenen auf neuronalen Zellen ist sehr nützlich, um die Gehirnfunktionen besser zu verstehen.
Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll zur Visualisierung neuronaler Strukturen mit Skalen von der mesoskopischen / Schaltung bis zur mikroskopischen / subzellulären Ebene mit ScaleSF zur Verfügung. Das Protokoll umfasst die Gewebepräparation, die Gewebeklärung, die Handhabung von gereinigtem Gewebe und die konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie (CLSM) der Bildgebung von gereinigtem Gewebe. Unser Protokoll konzentriert sich auf die Abfrage neuronaler Strukturen von Schaltkreis- bis hin zu subzellulären Komponentenskalen. Ein detailliertes Verfahren zur Herstellung der Lösungen und zur stereotaktischen Injektion von Adeno-assoziierten Virusvektoren (AAV) in das Gehirn von Mäusen finden Sie in Miyawaki et al. 2016 7 bzw. Okamoto et al.2021 8.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kritische Schritte innerhalb des Protokolls
Es gibt ein paar kritische Schritte im Protokoll, die mit äußerster Vorsicht durchgeführt werden sollten, um aussagekräftige Ergebnisse zu erzielen. Eine gleichmäßige Fixierung der Proben ist für die 3D-Bildgebung in großflächigen Geweben unerlässlich. Die Objektivlinse, die Probe und die Tauchflüssigkeit sollten über eine passende RI verfügen. RI-Mismatch zwischen ihnen führt zu einer stark gestörten Bildgebung von EGFP-exprimierenden Zellen …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Yoko Ishida (Juntendo University) für die AAV-Vektorproduktion und Kisara Hoshino (Juntendo University) für die technische Unterstützung. Diese Studie wurde unterstützt von JSPS KAKENHI (JP20K07231 to K.Y.; JP21H03529 bis T.F.; JP20K07743 bis M.K.; JP21H02592 bis H.H.) und wissenschaftliche Forschung zum innovativen Bereich “Resonance Bio” (JP18H04743 bis H.H.). Diese Studie wurde auch von der Japan Agency for Medical Research and Development (AMED) (JP21dm0207112 to T.F. and H.H.), Moonshot R&D von der Japan Science and Technology Agency (JST) (JPMJMS2024 to H.H.), Fusion Oriented Research for disruptive Science and Technology (FOREST) von JST (JPMJFR204D to H.H.), Grants-in-Aid des Research Institute for Diseases of Old Age an der Juntendo University School of Medicine (X2016 to K.Y.; X2001 to H.H.), und das Private School Branding Project.
Materials
| 16x multi-immersion objective lens | Leica Microsystems | HC FLUOTAR 16x/0.60 IMM CORR VISIR | |
| Agar | Nacalai Tesque | 01028-85 | |
| Agarose | TaKaRa Bio | L03 | |
| Dimethyl sulfoxide | Nacalai Tesque | 13407-45 | |
| D-Sorbitol | Nacalai Tesque | 06286-55 | |
| γ-cyclodextrin | Wako Pure Chemical Industries | 037-10643 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| Huygens Essential | Scientific Volume Imaging | ver. 18.10.0p8/21.10.1p0 64b | |
| Imaris | Bitplane | ver. 9.0.0 | |
| Leica Application Suite X | Leica Microsystems | LAS X, ver. 3.5.5.19976 | |
| Methyl-β-cyclodextrin | Tokyo Chemical Industry | M1356 | |
| Paraformaldehyde | Merck Millipore | 1.04005.1000 | |
| Phosphate Buffered Saline (10x; pH 7.4) | Nacalai Tesque | 27575-31 | 10x PBS(–) |
| Sodium azide | Nacalai Tesque | 31233-55 | |
| Sodium pentobarbital | Kyoritsu Seiyaku | N/A | |
| TCS SP8 | Leica Microsystems | N/A | |
| Triton X-100 | Nacalai Tesque | 35501-15 | |
| Urea | Nacalai Tesque | 35940-65 | |
| Vibrating tissue slicer | Dosaka EM | PRO7N |
References
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