Mezoskopikten Mikroskobik Ölçeklere Nöronal Görüntüleme için Bir Doku Temizleme Yöntemi
Summary
Protokol, bir doku temizleme yöntemi olan ScaleSF kullanılarak beyin diliminde ayrıntılı bir nöronal görüntüleme yöntemi sağlar. Protokol, beyin dokusu hazırlama, doku berraklaştırma, temizlenmiş dilimlerin işlenmesi ve nöronal yapıların mezoskopikten mikroskobik seviyelere kadar konfokal lazer taramalı mikroskopi görüntülemesini içerir.
Abstract
Burada beyin dokularında mezoskopik seviyelerden mikroskobik seviyelere kadar nöronal yapıları görselleştirmek için ayrıntılı bir protokol sağlanmıştır. Nöral devrelerden hücre altı nöronal yapılara kadar değişen nöronal yapılar, ScaleSF ile optik olarak temizlenmiş fare beyin dilimlerinde görselleştirilir. Bu temizleme yöntemi, ScaleS’nin modifiye edilmiş bir versiyonudur ve güçlü temizleme kabiliyetinin yanı sıra floresan sinyallerinin ve yapısal bütünlüğün yüksek düzeyde korunmasını sağlayan doku dilimleri için hidrofilik bir doku temizleme yöntemidir. Özelleştirilebilir üç boyutlu (3D) baskılı görüntüleme odası, temizlenmiş beyin dokularının güvenilir bir şekilde monte edilmesi için tasarlanmıştır. Gelişmiş yeşil floresan protein geni taşıyan adeno ilişkili bir virüs vektörü ile enjekte edilen fare beyinleri,% 4 paraformaldehit ile sabitlendi ve titreşen bir doku dilimleyici ile 1 mm kalınlığında dilimler halinde kesildi. Beyin dilimleri, Sca l eS0 çözeltisi, fosfat tampon salin (-) ve ScaleS4 çözeltisi olmak üzere üç çözeltide sıralı inkübasyonları içeren temizleme protokolü izlenerek toplam 10.5-14.5 saat boyunca temizlendi. Temizlenmiş beyin dilimleri görüntüleme odasına monte edildi ve ScaleS4D25 (0) çözeltisinde çözünmüş% 1.5 agaroz jeline gömüldü. Dilimlerin 3D görüntü alımı, uzun bir çalışma mesafesine sahip çok daldırmalı objektif bir lens ile donatılmış bir konfokal lazer tarama mikroskobu kullanılarak gerçekleştirildi. Mezoskopik nöronal görüntüleme ile başlayarak, optik olarak temizlenmiş beyin dilimlerinde dendritik dikenler ve aksonal butonlar gibi ince hücre altı nöronal yapıları görselleştirmeyi başardık. Bu protokol, devreden hücre altı bileşen ölçeklerine kadar nöronal yapıların anlaşılmasını kolaylaştıracaktır.
Introduction
Doku temizleme yöntemleri, biyolojik ve klinik örneklerin ışık mikroskobu ile derinlikten bağımsız görüntülenmesini geliştirerek bozulmamış dokular üzerindeki yapısal bilgilerin çıkarılmasına olanak sağlamıştır 1,2. Optik temizleme teknikleri de potansiyel olarak hızlanabilir ve histolojik analiz maliyetini azaltabilir. Şu anda, üç ana temizleme yaklaşımı mevcuttur: hidrofilik, hidrofobik ve hidrojel bazlı yöntemler 1,2. Hidrofilik yaklaşımlar floresan sinyallerini ve doku bütünlüğünü korumada aşar ve diğer iki yaklaşıma kıyasla daha az toksiktir 3,4.
Bir hidrofilik temizleme yöntemi olan ScaleS, yapısal ve moleküler bütünlüğün korunmasının yanı sıra güçlü temizleme kabiliyeti (temizleme-koruma spektrumu) ile ayırt edici bir konuma sahiptir5. Önceki bir çalışmada, Sca l eS6’nın temizleme prosedürünü değiştirerek doku dilimleri (~ 1 mm kalınlığında) için hızlı ve izometrik bir temizleme protokolü olan ScaleSF’yi geliştirdik. Bu temizleme protokolü, beyin dilimlerinin 10.5-14.5 saat boyunca üç çözeltide sıralı inkübasyonunu gerektirir. Yöntem, elektron mikroskobu (EM) analizi (Ek Şekil 1) ile bile uyumlu olan ve doğru sinyal rekonstrüksiyonu ile çok ölçekli yüksek çözünürlüklü üç boyutlu (3D) görüntülemeye izin veren yüksek bir temizleme-koruma spektrumu ile donatılmıştır6. Bu nedenle, ScaleSF, özellikle nöronal hücrelerin muazzam uzunlukta coşkulu süreçleri detaylandırdığı ve bilgi iletmek ve almak için uzmanlaşmış ince hücre altı yapıları düzenlediği beyinde etkili olmalıdır. Nöronal hücreler üzerinde devreden hücre altı seviyelere kadar olan ölçeklerle yapısal bilginin çıkarılması, beyin fonksiyonlarının daha iyi anlaşılması için oldukça yararlıdır.
Burada, ScaleSF kullanarak mezoskopik / devreden mikroskobik / hücre altı seviyeye kadar ölçeklerle nöronal yapıları görselleştirmek için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Protokol, doku hazırlama, doku berraklaştırma, temizlenmiş dokuların işlenmesi ve temizlenmiş dokuların konfokal lazer tarama mikroskopisi (CLSM) görüntülemesini içerir. Protokolümüz, devreden hücre altı bileşen ölçeklerine kadar nöronal yapıları sorgulamaya odaklanmaktadır. Adeno ilişkili virüs (AAV) vektörlerinin fare beyinlerine çözeltilerinin hazırlanması ve stereotaksik enjeksiyonu için ayrıntılı bir prosedür için, sırasıyla Miyawaki ve ark. 20167 ve Okamoto ve ark. 20218’e bakınız.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokol içindeki kritik adımlar
Protokolde, anlamlı sonuçlar elde etmek için azami dikkatle yürütülmesi gereken birkaç kritik adım vardır. Numunelerin düzgün bir şekilde sabitlenmesi, büyük ölçekli dokularda 3D görüntüleme için zorunludur. Objektif lens, numune ve daldırma sıvısı eşleşen RI’ya sahip olmalıdır. Aralarındaki RI-uyumsuzluğu, temizlenmiş beyin dilimleri içindeki EGFP eksprese eden hücrelerin oldukça rahatsız edici görüntülenmesine yol açacaktır (…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, AAV vektör üretimi için Yoko Ishida’ya (Juntendo Üniversitesi) ve teknik yardım için Kisara Hoshino’ya (Juntendo Üniversitesi) teşekkür eder. Bu çalışma JSPS KAKENHI (JP20K07231 to K.Y.; JP21H03529 için T.F.; JP20K07743 için M.K.; JP21H02592 için H.H.) ve Yenilikçi Alan “Rezonans Biyosu” Üzerine Bilimsel Araştırma (JP18H04743 ila H.H.). Bu çalışma aynı zamanda Japonya Tıbbi Araştırma ve Geliştirme Ajansı (AMED) (JP21dm0207112’den T.F. ve H.H.’ye), Japonya Bilim ve Teknoloji Ajansı’ndan (JST) Moonshot Ar-Ge’si (JPMJMS2024’ten H.H.’ye), JST’den Yıkıcı Bilim ve Teknoloji için Füzyon Odaklı Araştırma (FOREST) (JPMJFR204D’den H.H.’ye), Juntendo Üniversitesi Tıp Fakültesi Yaşlılık Hastalıkları Araştırma Enstitüsü’nden Yardım-Hibeler (X2016’dan K.Y.’ye; X2001’den H.H.’ye) ve Özel Okul Markalaşma Projesi.
Materials
| 16x multi-immersion objective lens | Leica Microsystems | HC FLUOTAR 16x/0.60 IMM CORR VISIR | |
| Agar | Nacalai Tesque | 01028-85 | |
| Agarose | TaKaRa Bio | L03 | |
| Dimethyl sulfoxide | Nacalai Tesque | 13407-45 | |
| D-Sorbitol | Nacalai Tesque | 06286-55 | |
| γ-cyclodextrin | Wako Pure Chemical Industries | 037-10643 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| Huygens Essential | Scientific Volume Imaging | ver. 18.10.0p8/21.10.1p0 64b | |
| Imaris | Bitplane | ver. 9.0.0 | |
| Leica Application Suite X | Leica Microsystems | LAS X, ver. 3.5.5.19976 | |
| Methyl-β-cyclodextrin | Tokyo Chemical Industry | M1356 | |
| Paraformaldehyde | Merck Millipore | 1.04005.1000 | |
| Phosphate Buffered Saline (10x; pH 7.4) | Nacalai Tesque | 27575-31 | 10x PBS(–) |
| Sodium azide | Nacalai Tesque | 31233-55 | |
| Sodium pentobarbital | Kyoritsu Seiyaku | N/A | |
| TCS SP8 | Leica Microsystems | N/A | |
| Triton X-100 | Nacalai Tesque | 35501-15 | |
| Urea | Nacalai Tesque | 35940-65 | |
| Vibrating tissue slicer | Dosaka EM | PRO7N |
References
- Susaki, E. A., Ueda, H. R. Whole-body and whole-organ clearing and imaging techniques with single-cell resolution: Toward organism-level systems biology in mammals. Cell Chemical Biology. 23 (1), 137-157 (2016).
- Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. Chemical principles in tissue clearing and staining protocols for whole-body cell profiling. Annual Reviews of Cell and Developmental Biology. 32, 713-741 (2016).
- Ueda, H. R., et al. Whole-brain profiling of cells and circuits in mammals by tissue clearing and light-sheet microscopy. Neuron. 106 (3), 369-387 (2020).
- Ueda, H. R., et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience. Nature Reviews. Neuroscience. 21 (2), 61-79 (2020).
- Hama, H., et al. ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging. Nature Neuroscience. 18 (10), 1518-1529 (2015).
- Furuta, T., et al. Multi-scale light microscopy/electron microscopy neuronal imaging from brain to synapse with a tissue clearing method, ScaleSF. iScience. 25 (1), 103601 (2022).
- Miyawaki, A., et al. Deep imaging of cleared brain by confocal laser-scanning microscopy. Protocol Exchange. , (2016).
- Okamoto, S., et al. Exclusive labeling of direct and indirect pathway neurons in the mouse neostriatum by an adeno-associated virus vector with Cre/lox system. STAR Protocols. 2 (1), 100230 (2021).
- Kameda, H., et al. Parvalbumin-producing cortical interneurons receive inhibitory inputs on proximal portions and cortical excitatory inputs on distal dendrites. The European Journal of Neuroscience. 35 (6), 838-854 (2012).
- Sohn, J., et al. A single vector platform for high-level gene transduction of central neurons: Adeno-associated virus vector equipped with the Tet-off system. PLoS One. 12 (1), 0169611 (2017).
- Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nature Neuroscience. 14 (11), 1481-1488 (2011).
- Stepanyants, A., Martinez, L. M., Ferecsko, A. S., Kisvarday, Z. F. The fractions of short- and long-range connections in the visual cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (9), 3555-3560 (2009).
- Kuramoto, E., et al. Two types of thalamocortical projections from the motor thalamic nuclei of the rat: a single neuron-tracing study using viral vectors. Cerebral Cortex. 19 (9), 2065-2077 (2009).
- Matsuda, W., et al. Single nigrostriatal dopaminergic neurons form widely spread and highly dense axonal arborizations in the neostriatum. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 29 (2), 444-453 (2009).
- Lin, R., et al. Cell-type-specific and projection-specific brain-wide reconstruction of single neurons. Nature Methods. 15 (12), 1033-1036 (2018).
- Winnubst, J., et al. Reconstruction of 1,000 projection neurons reveals new cell types and organization of long-range connectivity in the mouse brain. Cell. 179 (1), 268-281 (2019).
- Neckel, P. H., Mattheus, U., Hirt, B., Just, L., Mack, A. F. Large-scale tissue clearing (PACT): Technical evaluation and new perspectives in immunofluorescence, histology, and ultrastructure. Scientific Reports. 6, 34331 (2016).
